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制备型液相色谱(LC)

发布日期:2021-01-04 17:50 来源:Waters 作者:Waters 浏览次数:

制备型(Prep)液相色谱(LC)是采用色谱方法,将目标化合物从原料、副反应或其它杂质中分离出一定量达到足够纯度的化合物,以用于后续实验或处理的色谱方法。

分析条件到制备条件转换
https://www.waters.com/webassets/other/lp/prep_calc/AnalyticaltoPrep/NewPrepcalculator.htm

液相色谱纯化法:LC纯化系统的配置与一般液相色谱系统相同,但增加了馏分收集器。样品混合物经进样装置定量由流动相传输至色谱柱,色谱柱根据组分特有的化学或物理性质对其进行分离。由检测器检出组分,系统根据设置将流动样品输送至废液,或者收集器。收集操作中,检测器信号会触发馏分收集器将液流输送至收集容器中。输送至收集容器的馏分纯度取决于分离过程中化合物与其它邻近洗脱杂质的分离度。

图1:制备型LC系统

判断纯化分离成功与否的标准包括通量、回收率和所得分离物的纯度。
纯化分离由色谱峰的分离或“分离度”驱动。
以下是对分离度影响最为显著的色谱参数:

  • 色谱柱填料(固定相)
  • 溶剂强度
  • 溶剂类型
  • 缓冲液添加剂
  • 柱温

执行方法开发工作基本流程如下图所示:

图2:通用制备型工作流程

在设计工作流程之前,十分重要的考虑因素是目标化合物的性质。
如果从熟知的来源或新来源中分离已知化合物,很容易通过检索相关文献获取有关目标化合物色谱行为的信息,并从已发表的方法中选择适用的分离方法
对于含有未知类型化合物的粗提取物,设计分离方案的难度较大。在这种情况下,可在初始分离之后进行一系列探索性实验,获取更多有关目标化合物的信息,例如pKa、分子量、溶解性、稳定性、UV光谱和生物活性等。然后根据这些信息修改初始分离方法,使其符合化合物的化学和物理性质要求。这些信息不仅有助于方法开发,还可以在收集到馏分之后,为掌握目标产物的稳定性提供非常大的帮助。

第一步要制备样品并使用快速探索梯度执行常规分离。这一步通常为小规模分离,目的是节省宝贵的样品。根据该分离的结果,可以计算洗脱目标化合物的溶剂条件并进一步优化分离条件,尽可能提高分离度。此外,可能还需要对上样量进行研究,确定可维持适当分离度以实现高纯度分离的理想上样量。

确定分离方法和理想上样量后,通常要针对具有应用前景或潜在价值的分离物进行方法放大(但并不是必须执行)。术语“规模”(scale)描述满足产物纯度、通量和收率等应用目标所需的仪器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法,则需要将方法转换至硬件配置可处理更高上样量的系统。从本质上来讲,方法放大就是借助一系列方法放大计算和硬件更改,在分离度保持不变的前提下,将方法从分析级内径色谱柱转换到制备级内径色谱柱的过程

图3:用于分析级和制备级纯化的色谱柱内径对比

样品

可用于分离特定化合物的样品来源十分广泛,包括药物中间体、天然产物、保健食品、饮料和工业产品等。只要原料可以进行提取并溶解于液体基质中,就可以使用色谱纯化其中的各组分。

样品提取技术的选择取决于待提取原料的复杂性。对于天然产物,通常将样品干燥并研磨成细颗粒用以提高提取效率。接下来采用渗滤(用于大体积样品)或浸提(用于小体积样品)等技术提取目标化合物。这两种技术都需要向样品原料中加入溶剂,然后在超声、涡旋或浸泡后收集溶质。收集提取物之后,和所有HPLC样品一样,样品在进样前必须过滤,以除去颗粒并排除气泡。

分离模式

制备型色谱主要有四种分离模式:反相、正相、凝胶渗透和离子交换。合适的分离模式取决于待分析样品、提取物或混合物与固定相和溶剂之间的相容性。

反相色谱是开发纯化方法时最常用的技术,其使用极性弱于洗脱溶剂极性的固定相。反相色谱使用水与乙腈或甲醇的混合物作为洗脱液,其中还会添加缓冲液(酸或碱)用于控制样品的离子化程度以及结合固定相中未反应的游离硅醇基团,可减少峰拖尾并提高色谱重现性。

快速启动方法开发

建立反相分离方法时,通常选择小规格的分析型色谱柱(内径≤ 4.6 mm),并且其柱长和填料应可扩展至较大规格(内径≥ 10 mm)内径的色谱柱,以便将来放大方法。方法开发的关键是找到可实现出色分离的适用溶剂体系。对于酸性化合物,通常采用pH为酸性的水性流动相,并以甲醇或乙腈作为强溶剂。浓度为0.1%的甲酸是常用的缓冲液添加剂,因为其兼容UV和质谱检测。如需鉴定未知化合物或获取纯分离物用于进一步研究,MS兼容性将非常有用。如需让碱性分子保持未电离状态,可使用pH为碱性而非酸性的流动相。使用任何pH的缓冲液之前,都应参阅色谱柱固定相说明书了解其兼容性。水性流动相通常由位置A处的泵泵送,强溶剂由位置B处的泵泵送。本指南将分别使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶剂和强溶剂。

探索

尽管复杂的分离受色谱柱填料选择性的影响最大,但在开发纯化分离方法时,通过快速探索梯度得到初始样品分离方法并优化是十分有效的方法开发途径。探索梯度的作用是大致确定从色谱柱上洗脱目标化合物所需的溶剂浓度。
探索梯度一般从一致的强溶剂浓度(2%-10%)开始,线性增加至25%、50%、75%和90%-95%。


表1:快速线性梯度探索研究示例

 

图4:快速探索梯度。随着梯度斜率减小,分离度增大

运行探索梯度之后,在进行下一步之前应审查并评估所得结果,弄清以下问题:

  • 快速探索梯度的分离度是否足以分离目标化合物?
  • 快速探索梯度的速度或效率是否满足要求?
  • 采用所需上样量时,目标化合物与其它峰能否保持分离?

如果探索梯度结果未达到要求,可通过方法聚焦进行优化,也可通过更改pH值、溶剂或其它色谱变量对分离方法进行整体调整。

优化方法

通过改变强溶剂和弱溶剂组成可优化目标化合物分离度理想的探索梯度。溶剂组成可以保持恒定(等度),也可以根据给定的单位时间或色谱柱体积进行变化(梯度)。

等度洗脱

在等度分离中,弱溶剂和强溶剂比率在单位时间内保持不变。等度溶剂可由分析人员离线制备,或使用能以恒定的预定流速配比不同溶剂的HPLC泵通过在线混合制得。这种洗脱模式便捷、一致且稳定,因为在系统间转移方法时,延迟体积对保留时间的影响可以忽略不计。

等度洗脱有一定缺陷,并不是所有分离都适用。它的一些固有问题包括:早期洗脱峰分离度低、因峰拖尾导致峰对称性不佳、由于谱带增宽导致灵敏度降低,以及由于强保留化合物积累导致色谱柱污染问题等。

梯度洗脱

反相色谱或离子交换色谱中的梯度分离通常在线混合流动相,以便在整个分析过程中使有机溶剂比例稳定升高。梯度开始时,溶剂强度较低,分析物会被分配到固定相中或保留在色谱柱柱头。随着溶剂强度增加,分析物被转移到流动相,沿色谱柱移动,最终被洗脱。

梯度洗脱可在合理的时间范围内分离疏水性不同的多种分析物。另外,梯度洗脱还可提高峰分离度,由于峰高增加,灵敏度也有所提升。强保留组分会在运行结束时从色谱柱中洗脱出来,因此还可尽可能减少色谱柱污染。

当然,梯度洗脱也存在一些弊端。该方法要求实现一致、无脉冲的在线梯度混合,因此通常需要昂贵的泵设备。此外,采用某些溶剂的组合混合流动相时,可能会产生沉淀。由于梯度结束后需要重新平衡,运行时间会很长,而且因为仪器驻留时间(Vd)不同,若不适当使用补偿溶剂,会带来方法转换问题。

线性梯度

在整个运行过程中,线性梯度的强溶剂比例以恒定速率增加。该方法常在快速筛选实验中被用于快速确定洗脱目标峰的溶剂比例,同时保持较短的运行时间,从而缩短洗脱时间并降低溶剂成本。

图5:线性梯度的溶剂曲线

分段梯度

分段梯度是多个线性梯度的组合,每个区段具有不同的斜率或陡度。平缓的区段用于分离目标化合物,而陡峭的区段是对色谱图分离度要求不高的区域(例如分离后的清洗过程)。

图6:分段梯度的溶剂曲线

梯度聚焦

梯度聚焦通常比分段梯度的运行时间更短且变化更大。
一般情况下,刚进样时流动相的溶剂强度非常低,接下来溶剂强度会迅速升至洗脱目标化合物所需的溶剂比例以下2%-5%(例如,洗脱浓度22% - 2% = 20%开始平缓梯度)。然后运行平缓梯度,梯度斜率约为快速探索分离所确定的斜率的1/5,最后终止于目标化合物的洗脱浓度以上2%-5%(例如,22% + 2% = 24%终止平缓梯度)。最后,溶剂百分比快速增加,用以清洗残留在色谱柱中的所有样品组分。

 图7:梯度聚焦的溶剂曲线

开发梯度聚焦

采用快速探索梯度分析样品之后,可利用以下公式为目标化合物开发梯度聚焦。首先必须确定探索梯度运行所用仪器的系统延迟体积。关于延迟体积测定的说明可参阅本初学者指南的“延迟体积测定”部分,或访问www.waters.com/prepcalculator ,使用“分析级至制备级梯度转换器”应用工具获取。此外,还需确定探索梯度运行所用色谱柱的柱体积。使用圆柱体体积V = πr²h和除去填料所占体积之后的可用柱体积比例可计算出该值,例如V = πr²h (66%)。“分析级至制备级梯度转换器”应用程序工具也可用于执行此计算。

公式1:色谱柱体积

 

公式2:梯度形成和检测器之间的补偿体积

公式3:到达检测器所需的时间

公式4:达到洗脱浓度的时间

公式5:洗脱浓度(%)

公式6:色谱柱体积(CV)数 

公式7:探索梯度斜率

 

公式8:梯度聚焦斜率


梯度聚焦区段为:估算洗脱比例以下5%至该比例以上3%~5%。例如,洗脱比例为79%。

公式9:梯度聚焦区段的时长

最后一步是使用上述公式计算出的值创建梯度聚焦。
UPLC转换聚焦梯度换算
https://www.waters.com/webassets/other/lp/prep_calc/UPLCtoPrepFocusCalc/UPLCtoPrepFocusCalc.htm 
比较柱压和载样负荷https://www.waters.com/webassets/other/lp/prep_calc/ColumnBackpressures/PrepMass.htm

探索梯度:

时间 (mins)

流速 (mL/min)

溶剂

 

%A

%B

0.00

1.5

95

5

7.00

1.5

5

95

8.00

1.5

5

95

9.00

1.5

95

5

 

梯度聚焦:

时间 (mins)

流速 (mL/min)

溶剂

 

%A

%B

0.00

1.5

95

5

1.00

1.5

26

74

4.32

1.5

16

84

6.00

1.5

5

95

7.00

1.5

95

5

 

图8:采用快速梯度和梯度聚焦分离萘普生、苯氧苯丙酸、双氯芬酸和异丁苯丙酸所得的结果对比。可以看到用星号标记的目标峰在梯度聚焦分离中分离度更高且保留时间更短。


溶剂的影响:HPLC流动相由三种组分组成:弱溶剂、强溶剂和改性剂。溶剂必须具有高纯度、可与检测器兼容、不与样品反应,并且粘度应较低,以保持低系统背压。
反相色谱通常以水作为弱溶剂,常用的强溶剂是乙腈和/或甲醇,因为它们粘度低、溶剂强度高,并且在短波长范围内兼容UV检测。此外,乙腈和甲醇还能提供理想峰形,分离之后易于通过蒸发去除,而且不与大多数样品反应。和所有用于色谱分离的溶剂一样,分析样品时必须保持检测波长高于已知的溶剂UV截止波长值。若波长低于该值,检测器会将溶剂组分变化记录为基线漂移或其它色谱干扰。

表2:不同流动相的UV截止波长



峰分离和出峰顺序会根据分离所用的强溶剂不同而改变。预测可使目标化合物达到最高分离度的溶液非常困难,因此,通常需要通过试错法来确定强溶剂。或者,也可以使用混合强溶剂(例如,50:50乙腈/甲醇)达到理想的洗脱顺序或分离度。

图9:乙腈和甲醇的洗脱顺序对比


pH值:流动相pH值是控制反相分离保留性的一个非常重要的变量。化合物通常都含有一个或多个酸性或碱性官能团,因此大多数反相流动相的pH值都有必要加以控制。当酸的pH高于或低于其pKa 2个以上pH单位时,99%以上的酸将分别处于电离或未电离状态。相反,碱在pH值低于其pKa时电离,在pH值高于pKa时为未电离状态。未电离物质的极性较小(更疏水),因而在反相体系中保留性更强。因此,酸在低pH值条件下保留性更好,而碱在高pH值条件下保留性更好。

 


图10:流动相pH值对分析物保留性的影响
选择对应于保留图稳定区域的流动相pH值可实现十分稳定的分离。非电离形式的酸和碱保留性非常理想,而中性分析物的保留性不受pH值影响。
如果流动相pH值接近目标化合物的pKa,则很小的pH值变化也会显著影响其保留性,从而直接影响分离稳定性。我们通过添加缓冲液来控制流动相pH值。加入少量酸或碱时,缓冲液可保持pH值不变。缓冲液在其pKa ±1个pH值单位范围内使用十分有效,不过有的缓冲液在其pKa ±2个pH值单位范围内也具有足够的缓冲能力。

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