抑菌活性测定实验-生长速率法

　　抑菌活性测定大部分情况下需要在无菌环境中进行无菌操作，要保证所用器材和环境的清洁。培养基的制作和灭菌请参见“常用培养基的制作”和“高压蒸汽湿热灭菌”。

1   菌种转接

　　菌种在培养皿中或试管中生长一段时间后，由于培养基营养物质消耗及菌体老化，需要进行菌种的转接。菌种转接时可将一小块菌丝体或生长有菌丝体的培养基块倒扣接种在新鲜的培养基平面上（培养皿或试管斜面）。

2   菌种保存

　　保存用菌种必须转接在试管斜面，在25℃温度下培养三至四天，待新的菌丝体形成后放在4℃的冰箱中可保存3个月。3个月后应重新转接保存。

　　菌种应按时转接，避免污染和丢失。

3   药液配制和带药平板的制备

　　药剂配制时应在供试浓度的基础上扩大10倍。如要以0.1mg/mL的浓度进行抑菌活性的测定，则需要配制1mg/mL浓度的药液备用。原因在于带药平板的制备过程中将所配药液进行了稀释。

　　带药平板的制备是将供试化合物（或混合物）均匀分散在培养基中的过程。首先，取1mL用溶剂稀释好的药液，加入到刻度试管（20mL或25mL）中，再加入熔化好的培养基至10mL，充分混匀后倒入灭菌后的培养皿中，放置在平台上冷却后即制成带药平板。在这一过程中配制好的药液被培养基稀释了10倍。

　　为避免配制药液所有溶剂对病原菌的正常生长造成较大影响，可减少溶剂在培养基中的比例。尽管在实验中会设置以溶剂处理作为对照，但如果相对于空白处理，溶剂对病原菌的抑制作用过大则会造成实验结果不可信。解决此问题的具体方法是扩大供试药液的浓度，如需要测定0.1mg/mL浓度下某化合物的抑菌活性，若将其配制成5mg/mL的浓度，则制成平板时仅需要加入0.2mL的药液，再以培养基定容到10mL，这一过程共稀释了50倍，大大降低了溶剂在平板中的比例。

4   抑菌结果检查及统计

　　抑菌实验的结果检查采用十字交叉测量法。测量时严禁揭起皿盖。测量菌落时所取数据为通过菌饼中央部分的长直径和短直径（注意有些菌种菌丝较细、颜色较浅，不易观察，应对光观察）。每次测量的原始数据均应记录在记录本上，单位为mm。计算时以两次测量的平均值为一个菌落的生长直径，保留一位小数，单位为mm。

　　水稻纹枯病菌生长速度较快，在实验完毕，培养48h后开始检查结果。其余病原菌在未特别说明的情况下，72h后开始检查结果。需要进行连续观察时，在第一次检查结果后应每隔24h检查一次结果，连接检查三次。必要时培养直至对照组病菌长满整个培养皿。

　　注意：所有实验数据均应有记录本记录原始数据，并按要求输入电子表格中进行抑制率的计算和统计分析。