液相色谱柱体积、延迟体积、柱容量与柱头稀释

柱体积：液相色谱柱柱体积即柱体的容量体积，包含柱头接口部位的死体积。死体积指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积，其中包含柱头接口部位的体积，也即色谱柱内流动相的体积。如液相色谱柱4.6x250mm 30柱的体积约为124.6ml，计算公式同圆柱的体积计算，计算过程如下：
    1.液相色谱柱可以视为圆柱体。圆柱体的体积由公式v=π*r*r*h计算，其中r是液相色谱柱的半径，h是液相色谱柱的长度（即圆柱体的高度）。
    2.液相色谱柱的类型为4.6x250mm：内径为4.6mm，半径为2.3mm，长度为250mm，柱容为V3.14＊2.3＊2.3*2.3=4152.6立方毫米，转化为4.15265ml，即色谱柱4.6x250mm的柱体积为4.15265ml，不考虑柱的死体积。
    3.30倍柱4.6x250mm液相色谱柱体积为4.15265ml*30=124.5795ml，约124.6ml。

延迟体积：液相色谱更改系统或放大方法时，延迟体积（即系统体积或死体积）对于维持早洗脱峰的峰分离度很重要。延迟体积是指梯度形成处到色谱柱柱头之间的体积（即泵到柱头之间的体积）。在高压混合LC系统中，该体积主要包括混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积。低压混合系统包括来自泵的上游溶剂，因此这些额外的管路体积加上泵头（一个或多个）体积，再加上混合器、连接管路和自动进样器定量环的体积共同组成了总延迟体积。

图1：导致延迟体积的纯化流路组件（虚线圈出部分）

等度分离的流动相组分通过在线方式混合，这种情况下仍然存在延迟体积，但由于流动相浓度恒定，色谱分离结果中观察不到差异。另一方面，梯度方法则依赖流动相浓度随时间的变化实现峰分离。在梯度方法中补偿延迟体积可确保峰保留时间得以维持，需要收集纯馏分时，这一点尤为重要。延迟体积测定采用流动相A和含有UV吸收能力不同的添加剂（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流动相B溶剂组成分级梯度进行测定。

表1：确定延迟体积的步骤

图2：用于测定分析型系统和制备型系统的系统体积的分级梯度。

色谱柱容量：在纯化色谱分离中，保持目标化合物具有足够的分离度是一个关注重点。色谱柱容量（或称上样量）以化合物与邻近峰的分离度为衡量标准。虽然色谱柱容量主要受色谱柱柱长和内径影响，样品溶解性和样品混合物的复杂性等其它因素对此也有一定影响。色谱柱容量的趋势如下：色谱柱容量主要取决于具体样品的溶解性；简单混合物的色谱柱容量更高；如果需要较高的分离度，应降低色谱柱容量；色谱柱容量在很大程度上取决于上样条件。

表2：常用制备型色谱柱规格的估计上样量(mg)

示例：以4.6 x 50 mm的色谱柱为例，其预计上样量为每20 μL进样对应3 mg。

在方法放大之前，应通过上样量研究来确定特定目标化合物的理想上样量。这些研究以小规模进行，并采用以下其中一种方法：制备高浓度样品，然后逐步增大进样体积；或者制备多个浓度的样品，进样体积保持恒定。这两种方法的目标都是在保持目标化合物与邻近杂质之间具有足够分离度的前提下，确定可进样的最大样品浓度或进样体积。确定色谱柱容量后，可利用公式将其放大，不同规格色谱柱的数据可通过http://www.waters.com/prepcalculator 计算获得。

图3：上样量研究（星号标注的峰的分离度随上样量增大而降低）

柱头稀释：DMSO等强溶剂可以改善样品溶解性，进而可能增大色谱柱容量。然而，进样大体积的强溶剂会导致色谱峰畸变，这反而会减少可成功分离的产物量。若强溶剂从进样器输送到柱头的过程中在水性溶剂流中间形成溶剂簇，就会导致峰畸变。溶剂簇边缘的强样品溶剂被水性溶剂稀释，可能会引起样品沉淀，这种沉淀可能会堵塞流路塞，进而导致高压系统关闭。如果沉淀没有导致系统关闭，样品将进入色谱柱，但色谱柱上不会有样品被保留，直到样品簇被流动相稀释。进样体积较大时，样品簇必须沿着色谱柱移动相当长的一段距离才能达到所需的稀释度。在这种情况下，样品沉积为宽谱带，占据大部分色谱柱体积，这会导致需要大量洗脱液才能洗脱出很宽的峰，且峰分离度不足。通过严格限制进样体积和上样量可以避免这种情况。替代方法是用水或弱溶剂对样品进行充分稀释，以确保足够的保留性能。

图4：将样品溶于强溶剂中进样的传统进样方法。样品簇在沿着色谱柱移动的过程中被稀释，会导致峰畸变。

由于通量和回收率受到影响，上述两种方法都不理想。柱头稀释系统采用另一种配置，能够在色谱柱入口处使用水性稀释剂流对输送至此的样品簇进行连续稀释。输送至色谱柱的流速非常快，因此不会产生沉淀。接下来，样品分子会被吸附到填料上，形成非常窄的谱带，进而被洗脱为分离良好的小体积峰。柱头稀释还使得样品不容易在定量环或柱头处发生沉淀，因此能改善系统稳定性。由于样品组分峰之间的分离度得以改善，我们可以增大进样量，从而减少分离所需的进样次数。在实际操作中，采用柱头稀释通常可将色谱柱上样量提升3~5倍。发生高压关闭的频率降低，色谱柱寿命也更长。

图5：柱头稀释系统。样品簇被输送到色谱柱入口，并在此经水性稀释剂流连续稀释，因而不会产生沉淀。样品谱带可洗脱为具有理想分离度的小体积峰。

图6：采用传统进样方法和柱头稀释法进样溶于强溶剂的样品结果对比。柱上进样量为1000 μL（相当于133 mg）。