孢子染色法

1 原理
    微生物生长型细胞及孢子经孔雀绿染色后呈绿色，经脱色剂蒸馏水清洗，蒸馏水只能去除过剩染料及生长型细胞上之染料（孔雀绿对生长型细胞亲和力低），芽孢经染色后就不能以蒸馏水脱色，经复染剂沙黄（Safranin Solution)染色，生长型细胞呈红色，芽孢呈绿色。

2 步骤
2.1 标本制作
    取一载玻片于火焰上加热以去除油脂，放冷后于载玻片上加一滴无菌水，以接种环取少量菌种于无菌水上并涂抹均匀（约0.7×0.7㎝），最后载玻片于火焰上略微加热至水分干燥（需晃动避免加热于固定一点），使细胞固定再进行细胞染色。
2.2 染色
2.2.1初染
    滴一至两滴孔雀绿染剂于经固定之菌体上，于火焰上加热一分钟(需晃动），使染液冒水蒸气3~4次，促使染液渗透进入芽孢内。
2.2.2脱色
    以蒸馏水或自来水清洗，但不能直接冲洗固定之菌体，宜以缓水流通过固定之菌体（约30秒），将过剩染剂去除，此时生长细胞呈无色。
2.2.3复染
    加数滴沙黄染液，放置约30~60秒后，以水缓缓冲洗再将菌体周围用纸吸干，菌体上方加上盖玻片（倾斜放下，避免产生气泡），四周溢出之水分以纸吸取。
2.3 镜检
    打开光源开关，将光源调至适当光度。接物镜选择×100之物镜，目镜×15（品二显微镜最高倍率）。于盖玻片上方滴一至二滴杉木油（或矿物油），使油呈水滴状，将载玻片固定于载物台上，移至载物台开孔中央。旋转粗调节轮使接物镜前端浸于油中，并尽可能使物镜与盖玻片接近（眼睛在旁观视），再反转细调节轮缓缓将载玻片移开，以求得最佳焦距。利用转物轴调整钮可使载玻片前后左右移动，可得到其他视野之物象。此时生长细胞呈红色，孢子呈绿色。

3 药品配置
    孔雀绿染液：孔雀绿（Malachite Green)5.0克溶于100ml蒸馏水。
    沙黄染液：沙黄（Safranin Solution)0.5克溶于100ml蒸馏水。

4 注意事项
    取菌种时确保菌落已产生孢子。镜检后物镜可先用拭镜纸将油（油镜）擦拭干净，再用拭镜纸沾酒精（或乙醚）擦拭几次，最后再以拭镜纸擦拭干净。