ODS反相填料的装填
发布日期：2014-12-09 15:35
来源：网络
作者：AgroIPM
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ODS填料是在硅胶基质的表面键合十八烷基，由于其键合的配基和独特的硅胶表面，在物质分离中具有非常好的应用效果，广泛应用于天然产物提取、药物纯化、杂质分离鉴定中。
以下介绍20-150um的ODS填料的装填方法。
一、装填原理
当颗粒粒度大于10µm应采用等密度匀浆装填法。
匀浆技术是用合适的液体润湿颗粒，以消除填充颗粒的聚集结块问题。选择的液体可以减少由重力沉降作用而引起的颗粒粒径分级的现象。当浆液的密度与颗粒密度近似相等时，由重力作用产生的颗粒沉降相应的相应减少。
用湿法填充制备高效柱必须满足下列几项要求：
1.悬浮液中的填料颗粒必须不聚集结块。
2.填料颗粒在装进柱子前应该始终保持悬浮装态不得沉降分级。
3.为得到均匀紧密的柱床填充颗粒的浓度应合适流速尽可能大。
浆液不应与填料反应不使填料降解且填装完毕后应容易除去。填料颗粒必须有足够的强度和硬度。以承受填装过程中的机械应力。
表1 一些匀浆填充法用溶剂的性质
|
溶剂 |
密度ρ
g/mL |
粘度η
cp 20℃ |
溶剂 |
密度ρ
g/mL |
粘度η
cp 20℃ |
|
二碘甲烷 |
3.3 |
2.9 |
水 |
1.0 |
1.0 |
|
1,12,2-四溴乙烷 |
3.0 |
- |
吡啶 |
1.0 |
0.9 |
|
二溴甲烷 |
2.5 |
1.0 |
四氢呋喃 |
0.9 |
0.5 |
|
碘甲烷 |
2.3 |
0.5 |
正丁醇 |
0.8 |
3.0 |
|
四氯乙烯 |
1.6 |
0.9 |
正丙醇 |
0.8 |
1.2 |
|
四氯化碳 |
1.6 |
1.0 |
乙醇 |
0.8 |
0.6 |
|
氯仿 |
1.5 |
0.6 |
甲醇 |
0.8 |
1.0 |
|
三氯乙烯 |
1.5 |
0.6 |
环己烷 |
0.8 |
1.0 |
|
溴乙烷 |
1.5 |
0.4 |
正庚烷 |
0.7 |
0.4 |
|
二氯甲烷 |
1.3 |
0.4 |
异辛烷 |
0.7 |
0.5 |
|
乙二醇 |
1.11 |
1.7 |
|
|
|
二、装柱前准备
所需要的设备有：泵（HPLC或蠕动泵）、压力表、水平仪、玻璃/聚丙烯酸/PEEK或不锈钢层析柱、储槽（可选）等。
装填前准备工作：
1.柱子清洗干净检查没有明显的破损。
2.检测密封是否严格。
3.柱子要竖立与地面垂直。
4.在装柱前要用装柱的溶剂先冲刷色谱柱、柱筛板、管路
三、装填（在常温下操作）
3.1匀浆
表2 每升柱床体积填料量
|
填料类型 |
每升柱床填料量 |
|
ODS |
0.4-0.6 kg/lVc |
表3 建议使用的匀浆溶剂
|
填料类型 |
选用溶剂 |
|
YMC-ODS |
四氯化碳：四氢呋喃=2:1（v/v） |
|
GHGELODS |
氯仿：环己醇=1:1（v/v） |
|
SilicycleODS |
二氧六环：四氯化碳=1:2（v/v） |
表4 不同的装填方法选用的匀浆体积
|
装填技术 |
匀浆体积：柱床体积 |
|
轴向压缩 |
3:1 |
|
真空装填 |
2:1 |
根据所需装填柱子的体积称取适量的填料到容器里，容器的体积至少是匀浆体积的2倍，再根据具体的装填方式和装填的填料的类型按照表2、3、4制成合理的匀浆。为了充分浸润，建议用超声处理5-15分钟。
3.2恒流速/半恒压装填法
1.将柱底筛板用装填溶剂润湿，并将溶液放空一部分以便赶走所有的气泡。关闭柱底端出口，并在柱底部留出1~2cm高的装填溶剂。
2.再次将浆液搅拌均匀，以确保填料的均一。
3.小心将匀浆液倒入层析柱中，并注意避免倒入时产生气泡。
4.将匀浆液倒入后，用装有装填溶剂的喷壶清洗层析柱的内壁。
5.打开层析柱出口，开启泵或加压装置。最初，应让装填溶剂缓慢流过层析柱或压力逐渐增大。
6.采用恒流速装填法：利用输液泵缓慢输送装填溶剂增加至最终流速，这可以避免液压对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。流速可以阶段性地增大，增加量取决于层析柱的柱尺寸和流速。一般情况下装填流速为使用流速的2-3倍。表5中列举了部分例子。
表5 恒流速装填法中流速的增加量举例
|
柱尺寸 |
填料粒径 |
目标流速 |
操作流速 |
|
(I.D.´L) |
(mL/min) |
(mL/min) |
|
2.0cm´50cm |
20-25um |
60-120 |
20-40 |
|
4.0cm´50cm |
30-40um |
100-200 |
50-70 |
|
4.0cm´50cm |
50-75um |
180-350 |
90-120 |
|
4.0cm´100cm |
75-100um |
240-400 |
120-180 |
同等内径装填同样粒径的填料，柱长增加时为了降低压力降可以选择适当降低流速。
同样粒径填料装填到柱长相同，内径不同的色谱柱中，柱径大的色谱柱选择更大的流速，以减少洗脱时间。
表6 装填溶剂
|
填料类型 |
选用溶剂 |
|
YMC-ODS |
甲醇：水=80:20（v/v） |
|
GHGELODS |
甲醇：异丙醇=1:1（v/v） |
|
SilicycleODS |
|
7.半恒压装填法：利用加压装置缓慢增加至目标压力，这可以避免液压对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。可以通过手动操作增加流速来获得形成柱床所需要的稳定压力。对于ODS填料装填一般的压力5-12Mpa，如15um装填采用6.5Mpa的装填压力。
8.当柱床最终形成后，关闭泵或加压装置，并关闭层析柱出口，色谱柱装填完成。
四、色谱柱平衡与柱效评价
对于ODS填料：柱子的装填一旦完成后，首先用5~10倍柱体积的有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇溶剂，线性流速在5-10cm/min平衡柱床。测试装柱的效果，可以选用低分子量、弱极性的样品（如：尿嘧啶、苯甲酸甲酯、甲苯、萘）（进样量：0.25~1%柱体积）。确定柱子的塔板数及不对称性因子。按上述填装步骤装填的层析柱，在线性流速为5-10 cm/min（取决于填料粒径大小，填料粒径小为降低压力可以降低流速）时，最小的柱塔板数如表五所示、不对称性因子必须在0.8~1.4之间。
表7 填料装填最小塔板数
填料粒径
(um) |
理论塔板数
（N/m) |
|
20 |
20000 |
|
30 |
10000 |
|
50 |
5000 |
|
70 |
2500 |
|
100 |
1000 |
注意：
同等粒径的不同填料，由于填料的具体性质，理论塔板数也会略有不同。
装填后由于装填柱的内径和长度不同，影响了装填后的孔隙率，也会响理论塔板数。
理论塔板数与流速和物质是相关的，不同的物质和流速会得到不同的理论塔板数。
五、装柱的常见问题及原因
|
As<0.8 |
As>1.4 |
理论塔板高度过低 |
|
装柱过度 |
装柱时柱床未被压实、压紧 |
样品与填料上所键合的官能团或胶体间发生作用而被保留 |
|
装柱压力过高 |
柱头或柱底的筛板发生阻塞 |
|
柱床坍塌 |
柱头处有空隙 |
|
|
层析柱死体积内有空气 |
|
|
进样技术不高 |
峰对称因子As计算:
洗脱峰的峰形应尽可能对称，即对称因子尽可能接近1。
As按下列公式计算：As=b/a
其中，a为峰高10%处的前半个峰宽，b为峰高10%处后半个峰宽。
六、填料的再生及保存
ODS填料在使用过程中会有一些污染。为增加填料使用寿命，应选择合适的溶剂进行清洗。
1.一般情况下的常规清洗可以使用100%甲醇，100%丙酮。
2.长时间柱内正常有机物污染，可用75%丙酮：25%异丙醇，或100%异丙醇。
3.顽固有机污染物污染时可以使用100%乙酸乙酯，100%正己烷。
4.使用正己烷或乙酸乙酯前要用异丙醇冲洗柱子保持溶剂相溶。
5.一般情况下要冲洗10个以上的柱体积，冲洗过程中要注意柱子的压力，压力过高时降低流速进行清洗。
6.清洗检测大分子物质的ODS柱可以采用下述溶剂进行清洗后再进行常规清洗
|
溶剂 |
组成 |
|
乙酸 |
1%乙酸/水 |
|
三氟乙酸 |
1%三氟乙酸/水 |
|
0.1%三氟乙酸/丙醇 |
40:60（v/v）（降低流速） |
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脲或者鸟嘌呤 |
5-8M（调节pH6-8） |
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氯化钠、硫酸钠、磷酸钠 |
0.5-1.0M（磷酸钠pH7.0） |
|
DMSO或DMF-水 |
1：1 |
1、装柱用100%甲醇浸泡混悬数小时,使其膨胀就可以上柱。旧ODS填料的处理：先用100%甲醇浸泡数小时后，依次用甲醇、二氯甲烷、正己烷、二氯甲烷、甲醇洗涤，最后用100%甲醇浸泡即可。
2、平衡的话，可以用洗脱能力稍弱（相对你要分离的化合物而言）的甲醇/水洗脱相平衡约一个柱体积即可。
3、上样样品可用平衡用的洗脱相溶解，上样即可。
4、清洗及日常维护可以用100%甲醇冲洗柱子，或者如果填料比较脏的话可用1当量的盐酸与异丙醇的1：1混合液来处理填料，处理完后用纯甲醇平衡柱子（里面的盐酸，异丙醇应该冲洗干净）。
另：上样的样品最好是色素等杂质已经除得差不多了，这样可以保护填料，延长其使用寿命。
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