1． 准备序列文件
准备fasta格式序列文件（fasta格式：大于号>后紧跟序列名，换行后是序列。举例如下）。每条序列可以单独为一个文件，也可以把所有序列放在同一文件内。
核酸序列：
>sequence1_name
CCTGGCTCAGGATGAACGCT
氨基酸序列：
>sequence2_name
MQSPINSFKKALAEGRTQIGF
2． 多序列比对
打开MEGA 5，点击Align，选择Edit/Build Alignment，选择Create a new alignment，点击OK。
这时需要选择序列类型，核酸（DNA）或氨基酸（Protein）。
选择之后，在弹出的窗口中直接Ctrl + V粘贴序列（如果所有序列在同一个文件中，即可全选序列，复制）。也可以：点击Edit，选择Insert Sequence From File，选择序列文件（可多选）。
序列文件加载之后，呈蓝色背景（为选中状态）。点击按钮 ，选择Align DNA（如果是氨基酸序列，则会出现Align Protein）。弹出的窗口中设置比对参数，一般都是采用默认参数即可。点击OK，开始多序列比对。
比对完成后，呈现以下状态。
这时需要截齐两端含有---的序列：选中含有---的序列，按键Delete删除（注意：两端都需要截齐）。截齐之后，保存文件为：filename.mas
3． 构建系统进化树
多序列比对窗口，点击Data，选择Phylogenetic Analysis，弹出窗口询问：所用序列是否编码蛋白质，根据实际情况选择Yes或No。此时，多序列比对文件就激活了，可以返回MEGA 5主界面建树了。
MEGA 5主界面。点击Phylogeny，选择Construct/Test Neighbor-Joining Tree…弹出的对话框询问：是否使用当前激活的数据，选择Yes。这时弹出建树参数设置对话框，更改No. of Bootstrap Replications为1000，其他参数默认即可，点击Compute。
这里解释一下，Construct/Test Maximum Likelihood Tree…（ML）或Construct/Test Neighbor-Joining Tree…（NJ）或Construct/Test Minimum-Evolution Tree…（ME）为三种不同的建树方法，NJ方法最常用。
建树完成，效果如下所示。注意，要点击Bootstrap consensus tree查看树形。保存文件为filename.mts(可以用MEGA 5打开)。
4． 后期修改
为了美观，也是为了满足发表文章的要求，需要对进化树进行树形、字体、字号的修改。点击View，选择Options。弹出窗口中，在Tree标签中可以修改枝与枝之间的距离（Taxon Separation）、枝长（Branch Length）和树宽（Tree Width），调整至美观即可。Branch标签中，可以选择勾选“Hide values lower than %”，一般隐藏50%以下的数值。其他的参数可以自行研究，一般默认即可。
文字字体、字号的修改。
方法1：点击Image，选择Save as PDF file，保存至filename.pdf。打开软件Adobe Illustrator，文件---打开---选择刚刚保存的PDF文件。修改好之后，文件---导出---可以导出很多种类型的文件。一般选择保存成TIFF（.tif）文件，颜色模式选择RGB，勾选LZW压缩，其他默认。
方法2：点击Image，选择Copy to Clipboard。粘贴到Word中，右击进化树图片，编辑图片。即可更改字体字号。修改好可以了。或者进一步导出图片格式：先将该word文件打印生成PDF文件，再用Adobe Illustrator或Adobe Photoshop导出图片格式。
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