植物疫霉病菌分离与培养用培养基
发布日期：2013-12-25 11:22
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采用合适的培养基对成功分离和正确鉴定疫霉菌十分重要。许多疫霉菌的生长和产孢对培养基成份有特定的要求，例如一些疫霉菌在用于真菌分离和培养的常规马铃薯葡萄糖洋菜培养基上生长差，而许多疫霉菌产生孢子囊和卵孢子需要用V8或V6培养基。绝大多数疫霉菌可以在人工培养基上培养，而有少数疫霉菌如莎草疫霉(P.cyperi)、蒲草疫霉(P.lepironiae)和疣孢疫霉(P.verrucosa)等不能在人工培养基上培养，只能在活的植物组织上繁殖。一些在国外普遍使用的培养基,如V8培养基,由于在国内不易买到V8汁而难以广泛使用。以下介绍疫霉菌分离、培养、产孢常用的培养基配方、配制方法及主要用途。
一、利马豆培养基
利马豆粉60g，琼脂20g，水1000ml。
利马豆粉60g加水1000ml，在60°C下水浴1小时，双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml，加入琼脂粉20g，煮沸后持续沸腾数分钟，121°C高压蒸汽灭菌15~20分钟。
利马豆培养基适用于大多数疫霉菌的分离、培养、繁殖和保存，但不适用于培养马铃薯晚疫病菌。
利马豆俗称洋扁豆，在江苏南通及苏北等地有种植。利马豆培养基在加热过程中会产生大量气体，因此在灭菌前应充分煮沸，高压蒸汽灭菌结束后不要打开灭菌锅的放汽阀排汽，而是让其自然冷却减压，以防培养基冲开棉花塞。
二、Ⅴ8培养基
美国Campbell公司生产的，以8种蔬菜为主要成分混合制成的罐装V8汁作为主要原料，配制而成的培养基。因不同的实验要求，采用不同的配比，可配制成以下几种培养基:
(一)10% V8培养基 10ml V8汁加去离子水90ml，CaCO3 0.02g，琼脂2g。
适用于疫霉菌分离、培养、保存、诱导孢子囊产生、交配型测定和产生卵孢子。
(二)5% V8培养基 5ml V8汁加去离子水90ml，CaCO3 0.02g，洋菜2g。
适用于疫霉菌分离、培养和保存。
(三)10%V8培养液 100ml V8 汁加入COCO31g，在1500转/分下离心10分钟。上清液与去离子水按1:9比例稀释。
主要用于诱导产生孢子囊。
(四)0.2% V8培养基 取经离心的V8汁上清液0.2ml，加入去离子水100ml，琼脂粉2g。
用于游动孢子萌发和单游动孢子分离。疫霉菌游动孢子在这种培养基上的萌发率比在水洋菜培养基上的要高，且萌发后生长较好。为方便游动孢子萌发的观察和进行单孢分离，这种培养基要求使用质量较高的水洋菜粉。
上述培养基均采用121°C高压蒸汽灭菌15~20分钟。
三、V6培养基
以6种蔬菜混合制成的V6汁(商品名为维乐菜)为主要原料配制成的培养基。经比较，该培养基具有与V8培养基相似的效用，为V8汁的理想替代品。用国产V6汁代替美国产的V8汁，按与V8培养基相同的4种配方，可配制10%、5%、0.2%的V6培养基和I0%V6培养液，并各具有相同的用途。
四、胡萝卜培养基（CA）
将200g新鲜胡萝卜切成小片，加去离子水500ml，用组织捣碎机捣碎约40秒，用4层纱布过滤去渣，补足水至1000ml，加入琼脂20g，在121° C下高压蒸汽灭菌15~20 分钟。适用于多种疫霉菌的分离、培养和产生卵孢子。
五、燕麦培养基（OA）
燕麦片30g，加水1000m1在60°C下水浴1小时，双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml，加入琼脂20g，煮沸待琼脂熔化后分装。121°C下高压蒸汽灭菌15~20分钟。
适用于多种疫霉菌的分离、培养和诱导产生卵孢子。
六、玉米粉培养基（Corn Meal Medium，CMA）
玉米粉30g，水1000ml，琼脂20g。配制方法及用途与燕麦培养基相同。
七、番茄培养基
番茄汁20ml，CaCO3 0.4g，琼脂2g，去离子水80ml。
番茄汁的制备方法是，取新鲜成熟番茄果实，用自来水洗净后切成片，置于组织捣碎机中匀浆2分钟，经双层纱布过滤去种子和组织残余，滤过液即为所制各的番茄汁培养基在121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。适用于多种疫霉菌的培养和产孢。
八、大豆培养基（BA）
大豆汁10ml，洋菜2g，去离子水90ml。
大豆汁的制各方法是：60g干大豆种子用水洗净，浸泡过夜。浸泡过的大豆与330ml去离子水混合，用组织捣碎机破碎2分钟，经单层纱布过滤去渣。滤过液即为所制各的大豆汁。
培养基在121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。适用于多种疫霉菌的分离、培养与产孢。
九、黑麦培养基
黑麦50g，琼脂20g，去离子水1000ml。
取50g黑麦种子在1000ml去离子水中浸泡24~36小时,在121°C下高压蒸汽灭菌30分钟,经4层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml，加入洋菜20g。在120°C下高压蒸汽灭菌。
黑麦培养基特别适用于马铃薯晚疫病菌(P.infetans)的分离、培养与产孢。
十、色氨酸培养基
β-谷甾醇30g，L-色氨酸20mg，CaCl2 100mg，维生素B1 1mg，10%V8培养基1000ml。
将β-谷甾醇先溶于少量二氯甲烷(CH2Cl2)中，后加入10%V8培养基中，在121°C高压蒸汽中灭菌15分钟。L-色氨酸和维生素B1混合溶于少量水中单独灭菌，在使用前待培养基温度下降至50°C左右时加入，摇匀。
该培养基主要用于交配型测定和诱导产生卵孢子。一些在10%V8培养基上配对不产卵孢子或卵孢子产生量少的疫霉菌株，在这种培养基上可产生较多的卵孢子。
上述各配方，在缺乏五氯硝基苯时可用相同药量的多菌灵或苯莱特代替。
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