真菌一般形态观察和临时玻片制备
发布日期：2014-01-16 15:41
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真菌的分布很广，有一部分可寄生在动物和植物体上引起真菌病害。在植物病害中，真菌病害的数量最多。作物上常见的病害如黑粉病，锈病，白粉病和霜霉病等都是真菌寄生引起的。历史上有名的两次大饥荒就是由马铃薯晚疫病菌和水稻胡麻斑病菌为害所致。
1.目的要求
通过观察，认识病原真菌的营养体及其变态，认识真菌的子实体、有性繁殖，无性繁殖产生的各种类型抱子。
2.用具
挑针，刀片、木板，酒精灯，火柴，载玻片，盖玻片、纱布，乳酚油，二甲苯，显微镜，擦镜纸，吸水纸等。
3.内容与方法
3.1 病原真菌的营养体—真菌营养生长阶段的结构统称为真菌的营养体 真菌典型的营养体是丝状体，少数为单细胞。
单根丝状的营养体称为菌丝，许多菌丝在一起就称为菌丝体。用挑针挑取在培养皿内的瓜果脯霉病菌(Pylhium aphanidermatum)和立枯丝核菌(Rh；zoctoma solani)或镰刀菌的菌丝体，用蒸馏水或乳酚油作浮载剂，制临时玻片镜检，观察菌丝有无隔膜?菌丝体直径变化是否明显?颜色有无差别?
3.2 真菌营养体的变态 病原真菌营养体在一定条件下可发生变态而形成特殊的结构，这些变态是真菌适应性的表现，其作用是抵抗不良的环境条件，有利于传播，固着吸收和繁殖。主要的变态有吸器，假根、菌核，子座以及根状菌索等。
(1)吸器：吸器的形态有圆球状、棒状，裂片状、掌状，根状等。在示范镜下观察小麦白粉病菌(Erysiphe graminis)和大白菜霜霉病菌(Peronospora parasitica)的吸器形态，也可用小镊子撕取病叶的表皮，制临时玻片放在显微镜下观察，注意吸器的形状和在细胞内的位置。
(2)假根：是由菌丝分化的根状分枝。从培养皿内的培养基上挑取甘薯软腐病菌(Rhizopus stolonifer)制片，镜检，观察在孢囊梗基部的假根。
(3)菌核：是菌丝体的菌丝纠结而成的坚固的颗粒状休眠体。观察小核菌属(Selerotium)的菌核切片及标本，以及水稻和油莱上菌核的标本。比较两种菌核的大小，形状和色泽有何不同?
(4)根状菌索：许多菌丝体平行生长并纠结成绳索状，称为根状菌索。在示范镜下观察苹果或甘薯紫纹羽病菌的根状菌索。
(5)子座：由菌丝体或由菌丝体和寄主组织共同组成的着生于实体的垫状物。在子座上形成无性或有性孢于。在显微镜下观察麦角病菌(Claviceps purpurea)头状子座的切片，注意其内部结构与菌核有何区别，或镜检大叶黄杨叶斑病菌(Cercospora sp.)的垫状子座。
3.3 病原真菌的繁殖体—子实体 真菌产生孢子的机构称为子实体。病原真菌孢子的形态特征是鉴定和分类学上重要的依据。真菌的孢子可分为无性孢于和有性孢于两类：
3.3.1 无性孢子 指真菌无性繁殖过程中产生的各种孢子。这类孢子在形成过程中没有经过任何性结合的过程。
(1)游动孢子囊和游动孢子：鞭毛菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢子囊。大多数鞭毛菌孢子囊可释放出具鞭毛，在水中能游动的孢子，即游动孢子，故其孢子囊又称为游动孢子囊。镜检水霉菌(Saprolegnia spp．)、绵霉菌(Achlya spp．)或疫霉菌(Phytophthora spp．)在水中的培养物，注意观察菌丝有五分隔、孢子囊的形态、游动抱子的形成以及释放过程，，游动孢子休止后的形态，注意孢囊梗与菌丝有无区别。
(2)孢子囊和孢囊孢子：接合菌亚门真菌的无性繁殖器官是孢囊孢子。镜检根霉菌(Rhizopus spp．)，毛霉菌(Mucor spp．)，犁头霉菌(Absidia spp．)的孢子囊结构、孢囊孢子、孢囊梗、假根及匍甸丝。
(3)分生孢子：半知菌亚门真菌和子囊菌的无性世代繁殖时都可产生分生孢子。分生孢子的色泽、形态变化较大，从无色至深色、单孢到多孢，并具多种形态。分生孢子着生在分生孢子梗上，分生孢于梗有色或无色，散生或聚生，或着生在分生抱子盘或分生孢子器内。
采用挑、刮或切片的方法，观察下列各病害标本，注意观察其分生孢子的颜色，有陌或无隔，隔膜的类型及其形态，分生孢子梗的形态，是否分枝及分枝的类型、颜色，着生位置等，若着生在分生孢子盘或分生孢子器内，注意观察分生孢子盘或器的形态。
玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)
花生黑斑病菌(Cercospora arachidzcola)
小麦白粉病菌(无性世代)(Odram monilioides)
柑桔青霉病菌(Penicillium italicum)
棉花黄萎病菌(Vertioillium dahliae)
稻瘟病菌(Jiricularia oryzae)
马钤薯早疫病菌(Alternaria solani)
(4)厚壁袍子：又称厚垣孢于。由菌丝中个别细胞膨大，细胞壁加厚而形成的一种，厚壁孢子。对不良环境的抵抗能力较强。
挑取棉花枯萎病菌(Fusarmm oxysporum)或樟疫霉(Phyto Phthora cinnamomi)的培养物制片、镜检，观察厚垣孢子的形状、颜色和壁的厚度。
3.3.2 有性孢子 真菌有性生殖产生的抱于是由两个有亲和力的性细胞结合后发育形成的，包括卵孢子，接合孢子、子囊孢子和担孢子。
(1)卵孢子：是鞭毛菌亚门真菌产生的有性孢子，常由形态，大小不同的雌、雄性器官交配形成。卵孢子通常形成于藏卵器内，每个藏卵器内可包含I至多个卵孢子，其数目因真菌种类不同而异。
挑取水霉(Saprolegnia sp．)或绵霉(Achlya sp．)的菌丝团、腐霉(Pythiurre sp.)或疫霉(Fhytophthora sp．)的培养物(连同培养基)制片、镜检。
取禾谷类作物，如水稻，小麦、大麦，玉米等的霜霉病(Solerophthora macrospora)病组织做徒手切片。滴一滴乳酚油于载玻片上，挠几块切片于乳酚油中，在酒精灯火焰上微微加热，使病组织透明，盖上盖玻片、镜检，观察卵孢子形态。规察藏卵群的形态，色泽，壁光19或有饰纹，雄器形态及其位置，卵孢于形态，每个藏卵器内卵孢子的数目，卵孢于是否充满藏卵器。
(2)接合孢子：接合苗亚门真菌产生的有性孢子，由两个形状和大小相似的雄，雄配子囊结合而成。
挑取根霉(Rhizopus sp．)、毛霉(Mucor sp．)或梨头霉(Absidia sp.)正、负菌株在PDA培养基上交配7—10天后的培养物制片、镜检，观察接合孢子的形状，表面的饰纹、色泽、配囊柄的形状，有无丝状附属物。
(3)子囊孢子：子囊菌亚门真菌的有性孢子，产生在子囊内。子囊孢子有色或无色、单孢或多孢，具多种形状．子囊通常棍棒状，有的近球状，散生或着生在一定形态的子囊果内。
采用挑、刮或切片的方法，制片镜检下列病害标本。观察子囊孢子的形状，单细胞或多细胞，有色或无色，子囊的形状，是否具双层子囊壁，子囊有无固定孔口，于囊果的类型，有闭囊壳、子囊壳、子囊盘或于囊腔。
桃缩叶病菌(Taphrina deformans)
小麦白粉病菌(Erysiphe graminis)
桑里白粉病菌(Phyllactinia corylea)
小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)
苹果树腐烂病菌(Valsa mali)
麦角病菌(Claviceps purpurea)
(4)担孢子：担子菌亚门真菌产生的有性孢子。担孢子产生在担子上。冬孢菌纲的担孢子产生在冬孢子萌发后形成的担子上。
观察小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries)冬孢子萌发形成的担子及担孢子的形态。黑粉菌孢子萌发的条件是恒温(15—25℃)和定期的光照，连续培养3—5天，冬孢子即可萌发。
3.4 临时玻片
3.4.1 浮载剂 制作临时玻片都要使用浮载剂，浮载剂的作用是防止材料干燥和集中光线，以利于显微镜下观察。浮载剂的种类很多，最常用的是水和乳酚油，其次是甘油、甘油明胶，希尔浮载剂等。
(1)水：水浮载剂一般使用蒸馏水，应用最为方便。对细菌、真菌孢子等无不利影响。观察细菌溢、线虫活动，真菌孢子萌发都必须用水作浮载剂。测量真菌菌丝直径和真菌孢子大小时也以水作浮载剂为好。但是用水作浮载剂制片时较易形成气泡，制成的玻片也易干燥而不能保存。
(2)乳酚油：乳酚油长期以来一直是真菌学和植物病理学工作者习惯使用的浮载剂。乳酚油的组成如下，苯酚结晶(加热熔化)20ml。乳酸20ml，甘油40ml、水20ml。
各成分混合后成为油状粘稠液体，具杀死和固定病原物的作用，可使干瘪的真菌孢子膨胀复原，还可使病组织变得略为透明。如在乳酚油中加入0．05--0．1％的染料制成棉蓝乳酚油，藏红乳酚油等，还能使菌丝或孢子略微着色，更便于观察。用乳粉油制作的玻片可长期保持湿润不会干燥，它的缺点中，很难精确测量病原物的大小。另外，乳酚油能与许多封固剂起作用，盖玻片也易滑动，不易封固。
(3)希尔(Shear)浮载剂：其配方如下：2％醋酸钾水溶液、30ml、甘油120ml，酒精180ml。
3.4.2 临时玻片的制作 临时玻片制作方法很多，如涂，撕、粘，挑和切片等，可根据病原物的类型选择使用。
(1)涂抹法，细菌和酵母茼的培养物常用涂抹法制片。将细菌或酵母菌的悬浮液均匀地涂在洁净的载玻片上，在酒精灯火焰上烘干，固定，再加盖玻片封固。加盖玻片前还；可进行染色处理，使菌体或鞭毛着色而易于观察。
(2)撕取法，用小金屑镊子仔细撕下病部表皮或表皮毛制成临时玻片。此法可以现，察着生在寄主或基物衷面的菌丝和孢子，寄主表皮细胞内的真菌菌丝、吸器和休眠孢子囊堆，以及病毒病的内含体等。
试以小麦白粉病叶，烟草花叶病病叶，蚕豆花叶病叶，受禾谷多粘茵为害的小麦病根等为材料，用撕取法制作临时玻片，观察病原物的形态。
(3)粘贴法：将塑料胶带纸剪成边长5mm左右的小块，使胶面朝下贴在病部，轻按一下后揭下制成玻片。粘贴法用于菌丝或子实体着生于病组织或基物衷面的材料制片，特别适用于观察分生袍子在分生抱子梗上的着生情况。
(4)槐取怯，采用挑取法可以直接用挑针从病组织或基物(如培养基)上挑取表面的霉状物、粉状物或孢子团制成玻片。也可以先将埋生或半埋生的真菌子实体(如子座、分生孢子器，于囊壳等)连同部分病组织一同排列载玻片上，再用挑针将病菌子实体剥离出来制片。还可以用刀片刮取或用小镊子镊取病部子实体来制片。
(5)组织透明法：用水合氯醛或乳酚油或氢氧化钾液将病组织整体透明后再制成玻片。用于观察寄主组织内的细菌、真菌菌丝。吸器，子实体等，可以观察到病原物在寄主内的原有状态。
取病组织小块浸在乳酚油内煮30分钟，材料透明后取出制片。如病原物结构五色时还可加棉蓝，苯胺蓝或酸性晶红等染料染色。少量病组织材料可以放在载玻片上，滴加乳酚油后在酒精灯上徐徐加热至蒸气出现。如此处理数次，待组织透明后加盖玻片进行镜检。
(6)徒手切片：徒手切片是日常制作临时玻片时最常用的一种方法。制成的玻片可保持寄主组织和病原物原有的色泽，还可以观察病组织和病原物的解剖结构。切得好的徒手切片并不比石蜡切片差，而且非常方便。用树脂，指甲油或油漆封固后还可以作为半永久玻片保存。
选取病状典型，病征明显的病组织材料制作徒手切片，先在病健交界处切取病组织小块(边长5—8mm)，一般的叶片或茎秆皮层组织可直接敖在载玻片上或小木块上，用食指轻轻压住，随着手指慢慢地后退，用刀片将压住的病组织小块切成很薄的丝或片，切下的薄片立即放在盛有清水的培养皿或载玻片上的水滴中，用挑针或接种针挑取薄而合适的材料放在另一干净载玻片上的浮载剂液滴中央，盖上盖玻片，仔细擦去多余的浮载剂，即制成一张临时玻片。
病材料较粗大坚硬的，可用手指捏紧后用锋利的剃刀或单面刀片切。材料较小而柔软的，可夹在新鲜的胡萝卜或马铃薯块中间，连同夹持物一起切成薄片， 以下的制作步骤同叶片病组织制片。
病组织材料很干燥的， 为防止切片时发生破碎，可先沾少量水湿润软化后再切。徒手切片获得的是病组织及病原物的剖面薄片， 因而能够观察着生于寄主表面的病原物形态，也能够观察寄主组织内部的病原物。如寄主薄壁细胞内的细菌、埋生于寄主组织内的真菌子实体结构等等。此外，徒手切片还可以用来观察和研究寄主组织的病理变化情况。如分期或分段取病组织材料做徒手切片，能够观察病原物的侵染过程，病原物在寄主组织内的扩展情况，以及寄主组织本身的病理反应和变化等。
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