荧光标记技术
发布日期：2012-09-20 10:48
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荧光基团
吸收特定波长的光子后荧光染料(通常称为“荧光基团”或简称为“荧光素”)的化学键即被活化，其化学键活化的结果是发射波长更长的光子（能量更低）同时染料分子转变为基态。经常使用小的、化学稳定性好的荧光基团作为抗体和其他生物分子的标签或标记物，这样的荧光基团一般应具有合适的、高效的（强烈的）激发和发射波长范围。可以修饰荧光基团分子使其能够共价地连接到蛋白、核酸和其他生物分子上。荧光标记的（荧光的）探针广泛地应用于通过荧光显微镜、流式细胞技术或其他荧光读取设备检测蛋白。
荧光素异硫氰酸酯（FITC）的结构
这种广泛使用的荧光素衍生物染料含有三个环状结构，此结构赋予该分子荧光特性。对荧光素复合物的修饰是加入了异硫氰酸酯基团，通过该基团可以实现与抗体及其他含有氨基的探针的共价连接。
绿色、黄色和红色荧光染料的激发和发射光谱。DyLight488、549和649是替代荧光素(绿色), 罗丹明 (红色)和其他传统荧光染料的高强度、光稳定性好的荧光染料。
荧光标记
荧光标记是将荧光基团共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。通常使用能够选择性地与目标分子上存在的功能基团反应的荧光素基团衍生物来完成这样的过程。最常见的标记过的分子是抗体，经常使用标记过的抗体来检测特定的目标分子。可在多种检测系统中使用荧光标记来实现灵敏和定量的检测。经常使用具有化学反应活性的荧光基团衍生物来实现荧光标记。通常的反应活性基团包括与氨基反应的异硫氰酸酯衍生物，如FITC和TRITC(荧光素和罗丹明的衍生物)；和氨基反应的琥珀酰亚胺酯，如NHS-荧光素或NHS-罗丹明；以及和巯基反应的马来酰亚胺活化的荧光素，如荧光素-5-马来酰亚胺。这些具有反应活性的染料与其他分子进行反应会在荧光基团和标记的分子之间形成稳定的共价键。长久以来一直将异硫氰酸酯作为连接荧光染料和蛋白赖氨酸侧链上的伯胺的首选化合物，但是该化合物仍存在一些缺点。目前的标记方法中多选择NHS-酯化合物，这是由于该化合物具有针对伯胺的更高特异性并且能够形成更稳定的连接。与巯基反应的化合物在蛋白质标记的化合物中占有一小部分，经常在需要保存赖氨酸残基或者需要特异在蛋白上的半胱氨酸残基上标记荧光染料时使用这种化合物。在荧光标记反应之后经常需要从标记过的靶分子中去除未反应的荧光基团。通常根据荧光基团与标记的蛋白或者核酸等分子之间的分子量差距，通过分子筛来去除未反应的荧光基团。然而，很多荧光基团会与许多传统的分离介质产生相互作用从而导致分离和回收的效率很低。因此优选的染料去除柱是根据荧光染料的疏水特性而设计的。
荧光染料的选择
生命科学研究中使用的一些基于荧光的系统中经常使用荧光蛋白(例如，藻红蛋白)或生物发光报告系统。然而，这些技术非常耗时而且无法检测多个目标，同时与合成的荧光染料相比其灵敏度及光稳定性都不够好。使用荧光染料标记的特异性探针的荧光技术能够在基于细胞的应用中检测多个目标，并且与多种荧光设备兼容。虽然在生物学应用中荧光素、罗丹明及AMCA染料已经使用了很长时间，但是这些染料仍然有其局限性。最值得注意的是由于这些传统染料的荧光强度较低，因此限制了大多数应用的灵敏性；另外由于这些染料易被光漂白，因此限制了通常应用的灵敏度，并且限制了共聚焦显微镜应用中的景深及时差显微技术中的曝光。新一代的荧光基团可以超越这些传统的染料的限制。Thermo ScientificDyLight荧光素在亮度、光稳定性以及pH灵敏性等方面都有极大的提高。除了这些优点以外，新一代的荧光基团还能够覆盖全部的可见光谱及大部分红外光谱。
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