生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
发布日期：2012-09-19 19:41
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一、透析
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。
检查透析效果的方法是：用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。
为了提高透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司（Biomed Instruments Inc.）生产的各种型号的Zeineh 透析器，由于使用对流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。
二、 超滤
超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4×104 Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104 Pa～7×105 Pa，膜的平均孔径为10-100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105 Pa～140×105 Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。
超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。
在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。
超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。
超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05mm 和0.025mm。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜，其中一种各向异性扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔"皮肤层"（厚约0.1mm ～1.0mm ），和一层相对厚得多的（约1mm ）更易通渗的、作为支撑用的"海绵层"组成。皮肤层决定了膜的选择性，而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄，因此高效、通透性好、流量大，且不易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％ 叠氮化钠NaN3中保存。
超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/(cm2·h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。
超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。
三、冰冻干燥
冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。
冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明。
例如，冰在－40℃时其上方的蒸汽压为0.1毫米汞柱mmHg，在－60℃时其上方的蒸汽压为0.01毫米汞柱mmHg。固态的冰升华为水蒸汽时要吸收大量的热，1克0℃的冰变成0℃的蒸汽需吸热580千卡，所以升华时又可以使固态的冰进一步降温，空气潮湿时可以看见装有固态冰的容器外壁上结有霜。
冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点：①由于是由冰冻状态直接升华为汽态，所以样品不起泡，不暴沸。②得到的干粉样品不粘壁，易取出。③冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。
冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎，务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。
冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①准备一个较大的玻璃真空干燥器，将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内，器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5，干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连，抽真空后，经过5～10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内，将烧并浸入干冰～乙醇低温浴（－60℃）中，样品即被速冻成冰块，将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连，冷阱内放有干冰～乙醇混合液，冷阱的另一个出口管与真空泵相连，抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上，抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品，可重复以下的操作除去这些有机溶剂：样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品，如此反复多次，以除尽有机溶剂，否则样品不易冻干，且泵前应装有保护真空泵的缓冲并，以吸收水份和有机溶剂。
冰冻干燥操作虽然十分简单，但以下的注意事项却必须认真记取：
⑴样品溶液：①样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低，冰冻的样品容易融化，因而减压时会起大量泡沫，使样品变性、污染和损失。同时若含有有机溶剂，被抽入真空泵后溶于真空泵油，使其可达真空度降低而必须换油。②样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液在冰冻时，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结，因而使溶液pH下降而接近3.5，使某些对低pH敏感的酶变性失活，此时需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大，以免冻干的时间相差过大。
⑵装样品溶液的容器：①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长，耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm，否则烧杯易冻裂。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。
⑶溶液冰冻：如有条件，尽可能用干冰～乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。
⑷冻干：①样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。③冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。④仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油，通常半年或一季度至少要换一次油。
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