四．浸透和包埋
浸透
浸透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂，这种包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，并经加温后，能聚合成固体，以便进行超薄切片。目前常用的包埋剂是环氧树脂(epoxy resin)。环氧树脂是一类高分子聚合物，它的分子中含有两种反应基团，即环氧基和羟基。当加入酸酐类时，树脂分子中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接，这种起横桥式连接作用的交联剂叫做硬化剂，它们参与交联反应，并被吸收到树脂链中。常用的硬化剂有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，简称DDSA)、甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，简称MNA)及顺丁烯二酸酐等。当加入胺类时，就引起末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物。这种促进末端相接的交联剂叫做催化剂或加速剂。常用的加速剂有2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。为了改善包埋块的切割性能，某些环氧树脂包埋剂配方中还加有增塑剂，使包埋块具有适当的韧性。常用的增塑剂为邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)。
包埋操作
常规将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、60℃(36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。
包埋操作中应注意以下几点：
(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；
(2)所用器皿应烘干；
(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；
(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；
(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；
(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净。
五．超薄切片
超薄切片前的准备工作
1．修块
一般用手工对包埋块进行修整。将包埋块夹在特制的夹持器上，放在解剖显微镜下，用锋利的刀片先削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成锥体形。
2．半薄切片定位
利用超薄切片机切厚度为1μm-10μm的切片，称厚片或半薄切片。将切下的片子用镊子或小毛刷转移到干净的事先滴有蒸馏水的载玻片上，加温，使切片展平，干燥后经甲苯胺蓝染色，光学显微镜观察定位。
半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去其余部分。(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形(最好是梯形)，每边的长度为 0.2mm～0.3mm。
3．制刀
超薄切片使用的刀有两种：一种是玻璃刀，另一种是钻石刀。由于玻璃刀价格便宜，使用者较多。制刀用的玻璃为硬质玻璃，厚度为5mm～6.5mm。
玻璃刀用制刀机制作。制好玻璃刀后，要围绕刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有树胶水槽和胶布水槽两种。树胶水槽有固定的形状，可反复使用。胶布水槽是临时用胶布或专用塑料条制作的。装好水槽后，用熔化的石蜡封固接口，防止漏水。
4．载网和支持膜
4.1 载网
电镜中使用的载网有铜网、不锈钢网、镍网等，一般常用铜网。载网为圆形，直径3mm。网孔的形状有圆形、方形、单孔形等。网孔的数目不等，有100、200、300目等多种规格，可根据需要进行选择。
4.2 支持膜的制备
挑选并清洗好载网之后，要在载网上覆盖一层薄膜，这层薄膜称支持膜，厚度为10nm～20nm。对支持膜的要求是透明无结构，并能承受电子束的轰击。常用的支持膜有火棉胶膜及聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)，一般采用后者。
六．超薄切片的染色
未经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要进行染色处理，以增强样品的反差。一般是用重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附来达到染色的目的。重金属的原子对电子束形成散射，从而提高图象的反差。常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法有两种：
1．组织块染色
在脱水至70%乙醇或丙酮时，将组织块放在用70%乙醇或丙酮配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。
2．切片染色
预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于蜡板上，用镊子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿，染色10～20分钟。载网从染液中取出后，必须尽快用蒸馏水清洗干净。在染色过程中，铅染液容易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅颗粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液时，要尽量减少与空气的接触。为防止铅沉淀污染，可在培养皿内放置氢氧化钠丸，以吸收空气中的二氧化碳。
七、电镜观察、拍片、记录等
做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及相应内容，然后在电脑中备案。
