采用LC-MS代谢组学方法，对丹参根、茎、叶和花等部位的代谢产物进行了综合分析。利用自建库和公共数据库进行分析，初步鉴定出637种代谢物，得到了丹参不同植物部位的综合代谢组数据。代谢物类型主要为酚酸类、丹参酮类、黄酮类、脂类、碳水化合物、羧酸类和萜类。图1显示不同的组织部位代谢物谱表现出显著的差异。在根和花中主要富集的代谢物是丹参酮。PCA和OPLS-DA分析可以清晰地区分四个植物部位(图1C-F)，特别是地下和地上部位的差异。由OPLS-DA分析得到的S-plot图显示了地下部分和地上部分的代谢物分布的差异(图1G和H)。除了丹参酮在根中富集外，两种常见酚酸RA和SAB在地上和地下部分的积累模式不同，说明丹参酮在不同部位的生物合成途径可能存在差异（图1G和H）。

图1. 丹参不同植物部位的代谢组学和化学计量学分析结果

本研究基于正交阵列实验设计和化学计量学分析，建立了一个选择DESI-MSI最优参数的集成工作流(图2A-E)。以9个试验中检测到的所有代谢物为标准，根据计算出的k值，在负离子和正离子模式下进行参数优化，以获得最优的理论条件。作者对富含酚酸和丹参酮的根样品进行了DESI-MSI分析，验证了理论和最佳实验条件。这一验证步骤表明，试验7和试验9的最佳实验条件都能获得较高的灵敏度，这在丹参酮检测方面尤其如此(图2E)。以此为接下来的研究的最佳实验条件，并建立了高通量工作流程方案，以优化用于复杂生物混合物中的代谢物检测的DESI-MSI系统参数。

图2. DESI-MSI仪器参数优化及样品制备

植物组织具有不同的纹理和物理特性，很难开发出一种单一的植物组织制备方法，以适应可能的样品类型广泛性。为了开发一种合适的方法，作者使用丹参叶样品来优化样品制备方法，因为叶表面有一层蜡质层，使用喷雾溶剂很难穿透这层蜡质层来干扰分析。此外，由于丹参叶样品厚度较小，无法使用DESI-MSI冷冻切片。因此，作者研究了已公布的叶样品制备方法，采用压印法制备植物叶样品是最合适的，避免了样品厚度限制(图2)。但对于根等相对较厚的组织，不建议采用压印法，因为这样的样品会使PTFE膜的平整度发生畸变，从而扰乱成像过程，对成像结果产生显著影响(图2)。总之，样本厚度和大小是选择用于DESI-MSI分析的植物样本制备方法的两个关键因素。此外，由于像素成像固有的分辨率限制，在使用DESI-MSI时，只能评估叶片表面的代谢物分布。

实施优化条件后，作者进行了丹参不同组织中不同类别代谢产物的空间分布的可视化。作者采用P≥0.6的Pearson相关系数过滤，根据空间分布对真实图像进行快速筛选。最终，代表根、茎和花中12种不同空间分布代谢物的63张图像被筛选(图3)。并利用代谢组学结果辅助图像分析对代谢物进行定性。根中，主要代谢物是酚酸、碳水化合物和丹参酮。作为丹参中重要的生物活性代谢物，酚酸在皮质中特别丰富，丹参酮仅在周皮中检测到，其可能在保护根组织中起重要作用。碳水化合物是植物生长和防御的重要代谢物，这些代谢物几乎存在于除髓质外的所有根节部位。与根相比，地上部分的代谢物种类较多，酚酸是主要代谢物。与根的结果相似，茎中检测到的酚酸分布在皮层的外层(图3)。除酚酸外，在茎中检测到的代谢物主要分布在髓质中（帮助营养物质在植物中运输）。在地上部分富含黄酮类化合物，因为它们有助于保护植物免受食草动物、氧化和紫外线辐射的伤害。黄酮类化合物在花瓣上唇瓣和下唇瓣之间的分布不同，参与三羧酸循环的琥珀酸和柠檬酸主要位于花托内，这与花发育过程中控制花瓣的生长和脱落有关(图3)。

图3. 12种不同不同代谢物的空间质谱成像

为了获得关于植物代谢产物生物合成和积累以及可视化的信息，进行了黄酮类物质的DESI-MSI。黄酮类化合物经次级代谢物生物合成后分布于花、果、叶中，主要以黄酮苷类化合物积累。代谢组学研究结果表明，叶中黄酮类代谢产物种类繁多，而花中含量更高。图4为丹参花中类黄酮生物合成途径的主要代谢产物信息。DESI-MSI结果分析表明，芹菜素及其糖苷分布在花瓣的上唇瓣和下唇瓣(图4)，有助于保护植物免受食草动物和非生物胁迫。山奈酚及其糖苷仅位于花瓣下唇瓣，这与报道相符(图4)。同时DESI-MSI结果也揭示了黄酮苷的空间分布与其相应的苷元结构是一致的。因此，可以通过相应糖基化形式的图像预测有些微量类黄酮苷元的空间分布。例如，可以利用其糖基化产物芦丁的空间分布来预测槲皮素的位置(图4)。因此，代谢组学和DESI-MSI等强大的方法可以根据小分子的生物合成途径探索和预测其空间分布，从而推断代谢信息和遗传信息之间的关系。

图4. 基于LC-MS的代谢组学结合DESI-MSI研究丹参花黄酮类化合物生物合成的空间代谢组

接着，作者又分析了酚酸生物合成途径的代谢物分布。丹参中的酚酸是咖啡酸的衍生物，以单体、二聚体、三聚体、四聚体和多聚体形式存在。RA和SAB作为丹参中两种具有代表性的酚酸在地上和地下部分积累差异显著(图1G)，说明丹参不同部位可能存在多种生物合成途径来调控酚酸的积累。如图5A所示，作者通过代谢组学数据对检测到的与RA生物合成相关的代谢物进行了鉴定和半定量。在展示的四种理论途径中，基于丹参根部的¹³C痕量分析，途径1和3被证明有助于RA生物合成(图5A)。通过对DESI-MSI结果的分析，进一步探讨丹参酚酸生物合成途径中关键代谢产物的空间分布。由图5B-D可知，丹参素与其他酚酸在根、茎和花中的空间分布一致。咖啡酸分布广泛，特别是在茎部，表明咖啡酸是一种混杂的底物，可产生不同种类的代谢产物。因此，结合代谢组学和DESI-MSI结果，作者推测途径4是鼠尾草类植物产生RA的核心生物合成途径，丹参素是特定酚酸生物合成的关键前体。这种结合方法为了解植物中生物活性代谢物的生物合成提供了一个灵敏的平台，有利于筛选核心前体和功能基因。

图5. 基于LC-MS的代谢组学结合DESI-MSI探索丹参酚酸生物合成的空间代谢组

随后，检测了丹参中RA的几个具有代表性的下游产物，如紫草酸、紫草酸单甲酯和SAB（图5A）。三种具有呋喃环的酚酸在根中富集，而其他不具有呋喃环的酚酸主要富集在地上部分。两种咖啡酸三聚体，即丹酚酸A和C的裂解模式如图7A所示，证明了呋喃环的存在，因为杂环反应产生了2 Da的质量差。41种酚酸在植物各部位的积累情况如图7B所示，说明杂环化主要发生在根中。与丹参酮等在根中特异积累的代谢物类似，有报道称CYP71D亚家族的杂环化反应是多种丹参酮生物合成的关键反应。在其他8种鼠尾草属植物中，3种带呋喃环的酚酸主要在遗传相近的丹参根部位积累，说明杂环化是丹参和其他遗传相近的丹参根中形成特定酚酸的基础(图6)。此外，2020版中国药典仅使用丹参根作为中药的事实提示，根中含有呋喃环的酚酸和丹参酮的积累可能是根独特药理作用的主要驱动因素。同时，这些特异的杂环代谢产物可以作为发现鼠尾草属药用植物的化学标记物。

图6. 9种鼠尾草鼠植物叶片和根间代表性酚酸(咖啡酸、丹参素、L1、L2、L3、RA、litherospermic acid、litherospermicacid单甲酯和SAB)的相对含量

图7. 酚酸在地下和地上部分的结构差异