免疫金标记检测方法标准操作程序SOP

【目的】

  保证免疫金标技术检验准确性

【本SOP适用范围】

  免疫金标技术

【该SOP变动程序】

  本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【原理】

  氯化金分子在还原剂作用下聚合形成金颗粒，颗粒与颗粒之间因静电作用而相互排斥，使其保持一个比较稳定的胶体状态，故称作胶体金。利用胶体金颗粒的高电子密度及其表面能结合生物大分子(如抗体、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A等)以 及具有一定颜色等特性，可用光镜和电镜对细胞内抗原进行定位、定性的研究。

【方法学分类】

1. 斑点金免疫渗滤试验

  固相膜免疫测定中液体在微孔膜中穿过流出呈穿流形式，为斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有称免疫金溶胶斑点法、滴金免疫测定法等。试验单位为三层反应盒，第一层为过滤器(滤纸层)，第二层为反应膜(NC膜或MC膜)上点加有特异性抗原或抗体，第三层为吸水垫料，有称此渗滤装置为滴金反应板。

以双抗体夹心法测dsDNA为例：试验中将标本加在反应盒上，血清(标本)透过过滤层进入反应层，反应层上点有“一”字形抗IgG(或某种人血清蛋白作为试验阳性对照)及“．”形被测物相应抗体，血清中抗原与反应层中抗体结合，其余无关蛋白等滤出膜片，加入金标记抗体试剂，反应膜上“一”字形及“．”形均显红色为试验阳性，仅“一”形显红色为试验阴性(试剂盒状态良好)，“一”不显色提示试剂盒质量不合格，需另取反应盒重做试验。

试剂盒基本试剂成分有滴金反应板、金标记试剂及洗涤液。

2. 斑点金免疫层析试验

  固相膜免疫测定中液体通过毛细管作用在膜上向前移行呈横流形式，为斑点金免疫层析试验(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。试验单位为一滤膜条，自上而下分有多个层次。

  如单克隆双抗体法测HCG，滤膜条各区域分别为：吸水滤纸—固定有金标二抗的MC膜—固定有抗β-HCG抗体的MC膜—金标记抗。α-HCG玻璃纤维—吸尿玻璃纤维。试验中将滤膜条浸入被测尿液或滴加尿液，尿液在毛细管作用下向试纸条上端缓缓移行，尿液将金标抗。α-HCG溶解并带动它向前移动，结合尿中HCG至抗β-HCG抗体处形成复合物，并在抗β-HCG抗体固定处显示胶体金特有红色，提示试验阳性。尿中无HCG时，溶解的抗α-HCG至固定有金标二抗的MC膜处显示胶体金特有红色(质控线条)，提示试验阴性。

  试剂盒基本单位仅有一滤膜条，只有一步操作。

3. 胶体金颗粒的制备

  在氯化金溶液中加入不同的还原剂，可制备出不同大小的金颗粒。常采用柠檬酸、抗坏血酸和白磷。用这三种还原剂可分别制备出大、中、小三种主要胶体金颗粒。目前，有更多的实验室仅以柠檬酸为还原剂，在柠檬酸还原氯化金时，加入不同量的单宁酸即可获得大小不同的金颗粒，所制备金颗粒的大小非常一致。

[1] 以抗坏血酸为还原剂制备10~15nm直径的胶体金(Au l5) 在一个洗净烤干的250 ml容量的三角烧瓶中，加入20ml三蒸去离子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K₂CO₃和l ml％氯化金水溶液于冰浴中混匀，立即加入l ml 0.7%抗坏血酸，并充分摇动至溶液呈紫红色，加3DW至100ml，100℃水浴5min后，溶液变成红色，放室温冷却待用。

[2] 以柠檬酸为还原剂制备8~10 nm直径的胶体金(Au l0) 125 ml 3 DW煮沸后加入1%柠檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加入1.25 ml 1%氯化金溶液，100℃水浴15 min，溶液置室温待用。

[3] 以柠檬酸为还原剂制备5~6 nm直径胶体金(Au 6) 将l ml 1%氯化金加入100 ml 3DW中煮沸，快速加进2．45ml柠檬酸-单宁酸的混合液(2 ml 1%柠檬酸三钠、0.45 ml 1%单宁酸)，继续煮沸5 min，放室温待用。

[4] 白磷为还原剂制备5 nm直径的胶体金(Au 5) 将120 ml 3DW、1.5 ml 1%氯化金和2.7 ml 1 mol/L K₂CO₃，混合，缓慢搅拌中快速加进l ml白磷一乙醚溶液，室温轻搅拌15 min，100℃水浴30 min后放室温待用。

  胶体金制备一般需在中性pH(7.2左右)条件下进行，也可在稍偏酸或稍偏碱的环境中进行。制备的胶体金其大小和形状可在电镜下观察确定。一般胶体金溶液呈红葡萄酒颜色，大颗粒胶体金是紫红色。正常情况下，胶体金溶液应清澈而不含任何可见的沉淀或漂浮物，如溶液、试剂、瓶皿等不干净。将造成如下结果：第一不能获得预期大小的胶体金颗粒，第二将影响到下一步生物大分子的吸附过程和包被后胶体金的稳定性。因此，为了获得满意的胶体金，应选择最纯净的各有关试剂和液体。如有条件，所有试剂最好经过超过滤处理，以除去其中的分子聚合体和可能混入的杂质块。制备过程中所用的水以三蒸去离子水最合适，各类器皿均应严格清洗，盛胶体金的瓶皿先经过硅化则更为理想。胶体金颗粒在吸附生物大分子之前具有一定的稳定性，4℃可存放一周左右，如果经超过滤和透析处理后加0.002％ 叠氮钠，能保存5个月左右。

4. 胶体金和生物大分子的结合

  任何蛋白质都能结合到胶体金颗粒表面，胶体金和蛋白质结合后，并不影响蛋白质的反应性。

[1]生物大分子的准备 盐类成分能影响胶体金的吸附能力，并使胶体金颗粒发生聚集，因此，生物大分子在包被金颗粒前，常需透析，使溶液无盐或盐的浓度极低，常用的透析液为0.003 ml/L NaCI。

[2]胶体金颗粒的包被 以生物大分子包被胶体金颗粒时，首先需要确定其精确用量，即蛋白质完全包被胶体金所需蛋白质的最小剂量。因为过多或过少地结合生物大分子均可使胶体金呈不稳定状态，它们的最佳浓度可通过如下方法获得。制备好的胶体金以0.1mol/L K₂CO₃，调pH至6.2(SPA的等电点)待与SPA结合。用一个滴定盘或一排小试管，以0.005mol/L NaCl连续稀释50µl SPA(1mg/m1)至第十孔或第十管为止。然后，分别于每孔中加入250µ1的胶体金，5min后再加入250 µ1 10%NaCl，l min后震荡试管，这时SPA浓度较低的孔中，胶体金由红色变为紫色，说明SPA的量不足以包被胶体金。以胶体金未改变颜色，且SPA浓度最稀一孔胶体金与SPA的比例，计算出全部胶体金溶液所需SPA的总量，最后以10~20%过量加入到胶体金中，结合2~5min，再加入1%聚乙二醇(MW 20,000)至最终浓度为0.05%，以进一步稳定包埋后的胶体金。

[3]胶体金的浓缩纯化及储存 包被好的胶体金可用离心的方法使稳定的金颗粒沉淀于管底，而与多余的蛋白分开，使探针得以浓缩和纯化。将SPA-金颗粒复合物加到几个洗净的离心管中，再于离心管底部加进3~6 ml 5%甘油、0.05%聚乙二醇、0.02%叠氮钠的混合液垫层。纯化2~5nm的金探针时，以125,000×g离心45min(4℃)；纯化8~15nm直径金探针时，以60,000×g离心45~60min(4℃)。离心后SPA—金颗粒复合物浓缩于管底部，呈暗红色，尽量吸去无色上清后，收取暗红色层，而紧挨管壁的致密凝集块不应收集。浓缩纯化的胶体金探针置4℃保存待用，有效期约6个月。