制备液相中难溶样品的处理-柱头稀释

发布日期：2023-04-16 10:18　浏览次数：

DMSO等强溶剂可以改善样品溶解性，进而可能增大色谱柱容量。然而，进样大体积的强溶剂会导致色谱峰畸变，这反而会减少可成功分离的产物量。
若强溶剂从进样器输送到柱头的过程中在水性溶剂流中间形成溶剂簇，就会导致峰畸变。溶剂簇边缘的强样品溶剂被水性溶剂稀释，可能会引起样品沉淀，这种沉淀可能会堵塞流路塞，进而导致高压系统关闭。

图1.流动相在色谱柱内稀释样品簇。如果使用强稀释剂制备样品，则样品簇在流经含有水性流动相的色谱柱时，样品簇边缘可能会产生沉淀。

如果沉淀没有导致系统关闭，样品将进入色谱柱，但色谱柱上不会有样品被保留，直到样品簇被流动相稀释。
进样体积较大时，样品簇必须沿着色谱柱移动相当长的一段距离才能达到所需的稀释度。在这种情况下，样品沉积为宽谱带，占据大部分色谱柱体积，这会导致需要大量洗脱液才能洗脱出很宽的峰，且峰分离度不足。通过严格限制进样体积和上样量可以避免这种情况。
替代方法是用水或弱溶剂对样品进行充分稀释，以确保足够的保留性能。

图2.将样品溶于强溶剂中进样的传统进样方法。样品簇在沿着色谱柱移动的过程中被稀释，会导致峰畸变。

由于通量和回收率受到影响，上述两种方法都不理想。柱头稀释系统采用另一种配置，能够在色谱柱入口处使用水性稀释剂流对输送至此的样品簇进行连续稀释。
输送至色谱柱的流速非常快，因此不会产生沉淀。接下来，样品分子会被吸附到填料上，形成非常窄的谱带，进而被洗脱为分离良好的小体积峰。
柱头稀释还使得样品不容易在定量环或柱头处发生沉淀，因此能改善系统稳定性。
由于样品组分峰之间的分离度得以改善，我们可以增大进样量，从而减少分离所需的进样次数。
在实际操作中，采用柱头稀释通常可将色谱柱上样量提升3~5倍。发生高压关闭的频率降低，色谱柱寿命也更长。

图3.柱头稀释系统。样品簇被输送到色谱柱入口，并在此经水性稀释剂流连续稀释，因而不会产生沉淀。样品谱带可洗脱为具有理想分离度的小体积峰。

图4.采用传统进样方法和柱头稀释法进样溶于强溶剂的样品结果对比。柱上进样量为1000 µL（相当于133 mg）。

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