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几种MTT法实验步骤及注意事项

发布日期:2012-10-10 10:34 浏览次数:

普通MTT法实验步骤:
 
1: 接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞(细胞浓度的问题见后面的注意事项)接种到96孔板,每孔体积200ul.
2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
3: 呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)10ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。
4: 比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
 
 
药物MTT法实验步骤:

(1)贴壁细胞:
1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔,(细胞浓度的问题见后面的注意事项)。
2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午)加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况。
3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养,小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入100ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
(2)悬浮细胞
1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml(细胞浓度的问题见后面的注意事项),按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 1640)。
2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)。
4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
 
MTT法注意事项
 
(1) 选择适当得细胞接种浓度和培养时间
  一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以防止细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。因此,很多高手总结出“宁少勿多”的原则,这一原则在大多数情况下是适用的。
  对于体积大,增殖快的细胞,比如肿瘤细胞,在96孔板中不能接种太多数目的细胞。一般应该少于104个/孔。同时,细胞贴壁后不可培养过久,以防过于密集。大多数肿瘤细胞最佳点板浓度在4000-5000/孔,太少的话SD值会很大。
  对于体积小,增殖慢、悬浮的细胞,在96孔板中可以接种更多数目的细胞。甚至可以超过105个/孔。同时,为了观察药物对这类细胞的效果,可以较上一种细胞培养更长时间。
  在做肿瘤细胞的时候,往往要根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.
 
(2) 设置调零孔(只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul) 
(3) 设置空白孔(细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜)
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系 
(5) 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充,因为边缘的32孔中水分蒸发很快,药物易被浓缩,对实验影响大。同时加入pbs液填充后,可以一定程度上保持中间孔的水分。 
(6) 防止药物与MTT反应
  如果96孔板中加入了具有氧化还原性的药物,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议你用PBS将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是你不需要的。
(7) 吸收值分析
  在理想的MTT实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理的空白组的吸收值应该在0.8-1.2左右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。
(8)培养过程中换液
  100ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说,很难维持50h以上,如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果。如果培养时间长,在48h应该换液一次。
(9) 避免血清干扰
  高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。
(10)判断污染
  如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大。在加MTT前可以先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的。
(11)加DMSO前要把液体小心吸掉
  但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圆底型96孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。
  对于贴壁细胞,可以试着将96孔板倾斜30度角,然后用枪尖慢慢吸。
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