食品中总黄酮的测定

（一）目的意义

黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquidchromatography，HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。

（二）高效液相色谱法

1. 原理  植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。

2．仪器和试剂

（1）高效液相色谱仪

（2）紫外检测器

（3）层析柱

（4）超声波清洗仪

（5）索氏提取器

（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）

（7）甲醇（色谱纯）

（8）芦丁标准品

（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。

（10）去离子水

（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液。

3. 操作步骤

（1）样品处理

1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。

2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。

（2）色谱分离条件

色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;

流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；

流  速：lml／min；

柱  温：40℃；

检测波长：360nm；

灵敏度：0.02AUFS；

进样量：20ul。

（3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。

4．结果计算 

（三）分光光度法

1．原理  黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有4位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的3—羟基、4—羟基或5—羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。

本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。

2．仪器和试剂

（1）722分光光度计

（2）索氏提取器

（3）真空泵，盐基交换管等。

（4）恒温水浴，分液漏斗。

（5）芦丁标准品

（6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。

（7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。

（8）5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。

（9）聚酰胺树脂

（10）去离子水

（11）同前

3．操作步骤

（1）样品处理

1）固体样品：称取1～2g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在80℃水浴下回流3h，至提取液无色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶液，用30ml热水分3次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。

称取1～2g经预处理的层析聚酰胺树脂粉末(上海摩速公司生产)，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0ml／min，至流出液基本无色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。

2）液体样品：准确吸取1.0ml样品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。

（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相当于芦丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol／L氢氧化钠溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（r）。

（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。

4.结果计算  根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，求出总黄酮含量。

（四）说明

1．HPLC法与分光光度法比较，HPLC法相对干扰少，重现性好，测定结果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。

2．样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此样品水解后应尽快测定。

3. 随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定。