蛋白质组与蛋白质组学

一、蛋白质组概念：
　　一个细胞、一个组织或一个机体全部基因所表达的全部蛋白质。

蛋白质组学过程图

二、蛋白质组学研究范畴
　1.蛋白质和蛋白质间
　2.蛋白质和核酸之间
　3.蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定
　4.蛋白质结构分析
　5.生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异
　6.蛋白质信息库

三、蛋白质-蛋白质
　1.蛋白质亚基聚合：构像改变；四级结构
　2.交叉聚合：同工酶（LDH）
　3.分子识别：（如抗原-抗体）生物大分子间特异性、专一性的识别和结合；构像互补或构像变化产生互补的结构域；化学基团相互间存在足够的结合力。
　4.分子自我装配：大分子的相互识别和结合
　5.多酶复合体：多种酶相互结合形成一种新的结构。如丙酮酸脱氢酶

四、蛋白质间的相互作用力
　　蛋白质内部：肽键
　　蛋白质间：非共价键、氢键、范德华力、疏水键、离子键

五、蛋白质相互作用研究方法
　1.酵母双杂交系统：灵敏度较高的蛋白质间相互作用的方法。
　　酵母杂交系统包括：转录调控区、报告基因和一对反式作用因子。

　　N端：报告基因转录因子特异DNA结合区；C端：调控目的基因转录的反式作用因子proteinX
　　N端：报告基因转录因子转录活化区； C端：调控目的基因转录的反式作用因子proteinY
　　protein X+protein Y           报告基因转录

　2.噬菌体
　　研究基因工程蛋白质间相互作用的方法。抗体基因文库和随机多肽构建，用于筛选基因工程抗体和多肽药物。也可以使用于体内蛋白质的相互作用的研究。

　3.生物传感芯片质谱

　　定性和定量检测蛋白质间相互作用的方法。以表面等离子激原共振为基础的生物分子相互作用的分析技术与质谱技术的结合。
　　1×1cm2芯片，以玻璃为支持物，上面固定羧甲基葡聚糖聚合物，将一些蛋白质（肽）固定在上面。蛋白质或肽样品流过固相支持物，从而将发生相互作用的蛋白质滞留在聚合物上。蛋白质量的增加，使入射光折光率改变，引起共振角改变。蛋白质量与共振角呈线性关系。该法快速、灵敏、特异，需要的蛋白质样品量1-10μg ，检测水平可达到非摩尔，精确度可达0.1％，检测时间只需要10钟。

　4.蛋白质工程中的定点诱变技术
　　通过蛋白质定点突变，改变特异功能域，研究蛋白质的哪些结构对功能产生影响。从而发现与疾病相关的蛋白质。

六、蛋白质-核酸相互作用
　1.凝胶滞后实验
　　蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时蛋白质－核酸的复合物比无蛋白质的探针在凝胶中泳动速度漫，表现为相对滞后。
　　聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质-核酸结合的简单、灵敏方法。可以检测到微量序列特异性DNA结合蛋白。既可以检测ＤＮＡ结合蛋白，又可以检测ＲＮＡ结合蛋白质。可以鉴定这种结合是否是特异性结合。在反应体系中加入非标记的探针，序列相同，那么两种探针与蛋白质的结合存在竞争性机制，随着竞争剂的增加，标记探针与蛋白质结合的带型逐渐变小或消失，证明此种结合为特异性结合。

　2.滤膜结合法
　　硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可以结合蛋白质，可以将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开来的方法。

　3.甲基化干扰实验
　　用来检测蛋白质的结合位点。甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。结合位点上未被修饰的DNA片段才能与蛋白结合，然后将DNA从被修饰的碱基处切割，电泳分离，结合蛋白的DNA在结合位点上不能被修饰，不能切断，可确定结合位点的位置。

　4.Dnase I 足纹分析
　　蛋白质精确结合位点的研究方法。Dnase I 可以切割DNA中磷酸二酯键，而结合蛋白质的DNA免于Dnase I水解，不能被切割。
　　方法：选择性末端标记DNA片段，加入蛋白质形成复合物，后加入Dnase I ，形成1个碱基的梯度，而蛋白质结合部位，留下空白。

　5.随机PCR
　　随机PCR可以模拟体内DNA-蛋白质相互作用机制。动态地观察DNA-蛋白质的结合情况。

　　随机ＰＣＲ试验的步骤
　　１）合成寡核苷酸：随机序列区域
　　２）标记核酸成探针
　　３）进行多次凝胶滞后实验
　　４）确定特异性探针后，进行克隆和测序，统计随机序列区域各碱基出现的数量，动态确定蛋白质结合部位。

　6.核酸-蛋白质杂交
　　southwestern杂交。鉴定蛋白质与DNA特异性结合，确定结合蛋白质的分子量。

　7.蛋白质－核酸紫外交联法
　　DNA－蛋白质复合物经紫外线照射后，导致交联。交联的部位在DNA的嘧啶碱基和蛋白质的多种氨基酸的侧链基团。紫外交联使ＤＮＡ上的标记转移到蛋白质上，进而可利用SDS-PAGE测定其分子量。

七、蛋白质组及其质点的分离与分析
　1.二维电泳（2-DE）
　　目前最有效的蛋白质分离技术。它包括等电聚焦凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。前者根据电荷的差异，后者根据分子量不同将各种蛋白质和成分分离。
　维电泳的原理
　　１）等电聚焦电泳：
　　两性电解质含有脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成稳定的ＰＨ梯度，当蛋白质电泳到其等电点处，净电荷为0，停留在此位置，进而将蛋白质分离开。现建立一种新的 IEF，使用固相ＰＨ梯度等电聚焦（IPG-IEF），它的分辨率比传统IEF具有更高分辨率，分辨率可以达到0.001pH。

　　2）SDS-PAGE
　　SDS：十二烷基硫酸钠是一种去污剂，从而使蛋白质获得负电荷，因此屏蔽蛋白质，因此电泳迁移率仅与分子大小相关。
　　2-DE步骤：样品制备、蛋白质的溶解、变性、还原以及去除、蛋白质杂质，IPG胶制备、双向电泳、蛋白质的染色。

　蛋白质染色：
    　1）考马斯亮蓝染色：蛋白质常用的染色方法，灵敏度比银染低，但利于蛋白质的图谱分析。
    　2）银染色： 是一种灵敏度高、分辨率好、应用广泛的方法。缺点是银染条带与蛋白质量不成比例，不便于蛋白质图谱分析。银染时常常造成蛋白质末端封闭，不能进行序列分析。

　2.蛋白质芯片技术:
   　 将蛋白质固定在硅物质表面,通过大分子之间的特异性识别和结合进行检测.

　3.质谱分析技术
    　原理:将样品离子化,根据不同的质量和电荷差异确定分子量的技术。
   　 应用:1）蛋白质序列分析：质谱形成的肽离子为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中肽健断裂，性成一系列碎片，进行序列分析；2） 蛋白质修饰分析。

八、 蛋白质分子结构分析
　　测定溶液中蛋白质结构:核磁共振、圆二色谱法、荧光光谱法等
　　测定晶体蛋白质结构：X射线衍射分析法、小角中子衍射法。

九、蛋白质数据库
（一）蛋白质序列数据库
   1.SWISS-PROT数据库：蛋白质序列、文献、分类等。
     http://www.ebi.ac.uk/swissprot
   2.PIR和PSD数据库：最大的数据库
     htpp://pir.georgetown.edu

（二）蛋白质结构数据库
　1.蛋白质数据仓库（PDB）：蛋白质分子的三维结构。（X光晶体衍射和核磁共振）
      http://www.rcsb.org/pdb
   2.蛋白质结构分类数据库（SCOP）：蛋白质之间的关系
      http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/
   3.PROSITE数据库：提供蛋白质位点和序列模式
      http://www.expasy.ch/proside/

十、蛋白质组学研究：
　1.用于疾病诊断的研究
    2.发病机制的研究
    3.致病菌耐药性研究