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Sephadex LH 20的使用

时间:2011-11-15 10:50
来源:研究小组
作者:admin
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内容介绍

1          Sephadex LH 20介绍

Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25中引入羟丙基以代替分子中羟基上的氢,葡聚糖凝胶分子的葡萄糖部分将与羟丙基形成醚键连接,它属于分子筛凝胶。字母LH的含义是这种凝胶骨架在亲脂溶剂中或在水溶剂中都能溶胀。

ROH――→ROCH2CH2CH2OH

Sephadex G相比,Sephadex LH-20分子中-OH总数虽无改变,但碳原子所占比例却相对增加了,从而使葡聚糖的亲脂性增大。这种凝胶既有亲水性,又有亲脂性,不仅可在水中应用,也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中使用,如丁醇、氯仿、四氢呋喃、二氧六环等,应用范围增大。

2          Sephadex LH 20分离原理

SephadexLH20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。

因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱,SephadexLH20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。

SephadexLH-20除保留有Sephadex G-25原有的分子筛特性,可按分子量大小分离物质外,在有极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的效果,适用于不同类型有机物的分离,尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化,例如:类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等。同时也适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备,既可用于初步纯化步骤,也可用于最终精制步骤,如非对映同分异构体的分离。对黄酮、蒽醌、香豆素等成分也能分离。

3          Sephadex LH 20的使用

3.1       Sephadex LH 20使用注意事项

羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20虽然是一种两性凝胶,同时具备亲水和亲脂双重性质,但在不同溶剂中的溶胀因子各不相同(见表1),因此不允许在柱中直接更换溶剂,床体积在2.5mLg干胶以下的不能用于凝胶渗透色谱(GPC分析高聚物分子量分布)分析。这种凝胶在有机溶剂中分离较小分子量的脂溶性化合物是十分有效的。但在使用时不允许有氧化剂存在。

3.2       Sephadex LH 20使用步骤

3.2.1          层析条件选择

梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。流动相可参考TLC的条件,正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。极性大的用甲醇-水系统;极性小者一般用不含水的系统。有实验室常用正己烷-二氯甲烷-甲醇系统,效果较好。常用流动相为:水,甲醇,丙酮,乙酸乙酯,二氯甲烷(溶剂的极性依次降低)。

根据洗脱溶剂的极性,将SephadexLH20 洗脱溶剂分为两类:反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱,以甲醇-水系统最为常见,先用水,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。正相系统以氯仿-甲醇最为常见,先用50%氯仿-甲醇,逐渐增加甲醇比例,最后用100%甲醇冲柱。

随着流动相极性的降低,对带有极性的被分离物而言,保留值和分离度依次递增;同理选用的凝胶柱高可依次降低,流速可以增大(或上样量可以增加,树脂体积在低极性溶剂中明显收缩)。二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状(包括苯环)物质分离采用,葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。

3.2.2          装填层析柱

装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄),越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH-20而言,25100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言,不能说分布均一,也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱(最高至250cm)而言也是同样的。在装柱前,层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。

Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀。Sephadex LH-20不仅具有亲水性能,可以吸水膨胀,而且也可以吸收有机溶剂而膨胀。在不同的溶剂中,其色谱特性也不同。在溶胀的过程中,要尽量避免过分搅拌,否则会破坏球形胶粒,且要避免使用磁力搅拌器。在室温下,将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时,溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统,请参考1列举的在不同溶剂中浸泡后吸收溶剂而膨胀的体积
  溶胀所用溶液的量应使溶胀沉淀之后胶体积占总体积的75%,上层溶剂占总体积的25%,这时,悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。
  将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内,在保证胶粒不变形的前提下,应在尽可能高的压力下装柱,反压不要超过1.5ba。

溶胀好的凝胶在装填时用可直接在柱中摇匀凝胶-洗脱液的混合物,直立柱身,让其自然沉降,此时要防止气泡留在其中。打开开关,用洗脱液冲洗至少两个柱体积以稳定柱床。如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质,并根据性质确定柱高调节器的位置,如使用相同的溶剂,在以后的层析中柱平衡可以省略。

1 <葡聚糖凝胶在各种溶剂中的膨胀体积和吸收溶剂的能力

 

  

溶胀后的体积

(mL/g干凝胶)

溶剂吸收率

(mL/g干凝胶)

Dimethylsulphoxide二甲基亚砜

4.44.6

---

Pyridine吡啶

4.24.4

---

Water

4.04.4

2.1

Dimethylformamide二甲基二甲酰胺

4.04.4

2.2

Methanol甲醇

3.94.3

1.9

Chloroform*氯仿*

3.84.1

1.8

Methanedichloride 二氯乙烷

3.84.1

---

Propanol丙醇

3.74.0

---

Ethanol**乙醇**

3.63.9

1.8

Isobutanol 异丁醇

3.63.9

---

Formamide 甲酰胺

3.63.9

---

Methylenedichloride 二氯甲烷

3.63.9

---

Isopropanol 异丙醇

3.63.9

---

Butanol丁醇

3.53.8

1.6

Tetrahydrofuran四氢呋喃

3.33.6

1.4

Dioxane二氧六环

3.23.5

1.4

Acetone丙酮

2.42.6

0.8

Acetonitrile*** 乙腈

2.22.4

---

Carbontetrachloride四氯化碳

1.82.2

---

Benzene

1.62.0

---

Ethylacetate乙酸乙酯

1.62.0

0.4

Toluene甲苯

1.51.6

0.2

 

*包含1%的乙醇

**包含1%的苯

***溶胀胶体积小于2.5ml/g的溶剂没有使用价值

3.2.3          上样及洗脱

首先样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中,为确保延长层析柱的使用寿命,所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。样品体积应该占柱总体积的1-2%。采用湿法上柱,将溶解好的样品直接加在柱的顶端,注意保持柱面平整及样品层的平整。在溶解样品及洗脱时一般遵循以下原则:

1)如果样品极性大,选用反相溶剂洗脱(甲醇-水),样品用最少体积的甲醇-水(尽可能甲醇少一些)溶解,过滤后,湿法上样。

2)如果样品极性小,选用正相溶剂洗脱(氯仿-甲醇),样品用最少体积的氯仿-甲醇溶解,过滤后,湿法上样。

洗脱时的流速应根据情况而定,一般控制在1 drop/s以下,最大线性流速约12 cm/min(反压1.5ba),建议流速为1-10 cm/h总体来说,较低的流速,具有较高的分辨率。

体积流速与线性流速的关系:线性流速=体积流速/横截面积

在更换洗脱溶剂或进行调料再生时,需要特别注意溶剂更换的梯度不可以太大,以避免柱层中出现气泡或镂空。如果发现柱层析时样品色带的移动出现明显的速度不一致,建议重装柱子再分离。

3.3       Sephadex LH 20使用技巧

1)流速不可太快,切切不可心急,所谓欲速则不达。

2)柱子尽可能长,Sephadex LH-20柱长的增加将极大地改善分离,所以不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。

3)馏分一定要接的细,可1/10,或1/20个保留体积接成一馏分。

4)洗脱体积一般为2-3个保留体积,对特殊保留强的化合物,可洗脱5个保留体积。

5)鞣质成分死吸附严重,不建议用LH-20分鞣质。

6Sephadex LH-20对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。

7)填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。

3.4       Sephadex LH 20再生与保存

凝胶再生通常是先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗,如更换洗脱液,则需要重新平衡。

如果Sephadex LH20柱子被弄脏了,大多数情况下是由于样品没滤,将柱头堵住,或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染,一般的处理是将被污染的柱头部分的填料弃去。具体做法很简单,只要将被污染的柱头部分的填料用玻棒轻轻搅起,倒掉即可。

如果柱子整个被污染,如果Sephadex LH-20在用反相洗脱时被污染,可采用以下办法处理:依次用水,NaOH-NaCl水溶液,水,甲醇洗涤被污染的柱子。因为是整个柱子被污染,污染物一定不会完全死吸附在柱上(如果完全死吸附在柱上,污染物会仅存在于柱头部分),所以用合适的溶剂一定可以将之洗下来。(NaOH-NaCl水溶液配法:8g NaOH 30g NaCl1000ml 水)

Sephadex LH-20的保存要防止霉变,新填料 4-25℃(干燥);使用后填料 4-8℃pH6-8,切勿冷冻,加入抑菌剂(如20%乙醇,0.04%叠氮钠)。

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